ERG在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的意義

李丹丹 白玉勤

摘 要：目的：探討ERG在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及其預(yù)后意義。方法：選取2015年5月至2020年3月來(lái)該院就診的膀胱尿路上皮癌患者502例，使用免疫組化方法檢測(cè)ERG在腫瘤石蠟樣本中的表達(dá)情況，并使用x2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)分析ERG和微血管密度與膀胱尿路上皮癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果：ERG和VEGF在浸潤(rùn)性尿路上皮癌患者石蠟標(biāo)本組織中表達(dá)率顯著高于非浸潤(rùn)性尿路上皮癌，具有顯著差異（P<0.05）。經(jīng)x2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)分析ERG、微血管密度與腫瘤分級(jí)、腫瘤分期、淋巴結(jié)分期以及TNM分期均具有顯著差異（P<0.05），與性別無(wú)顯著差異（P>0.05）。結(jié)論：ERG的高表達(dá)可以提示腫瘤的浸潤(rùn)生長(zhǎng)和高侵襲性。ERG可作為輔助判斷膀胱尿路上皮癌浸潤(rùn)程度及惡性程度的生物學(xué)指標(biāo)，并且ERG有望成為靶向治療膀胱尿路上皮癌的新靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：ERG;微血管密度;膀胱尿路上皮癌

中圖分類(lèi)號(hào)：R737.14? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1673-260X（2022）02-0049-04

我們國(guó)家膀胱癌的發(fā)病率已躍居泌尿系統(tǒng)腫瘤首位，且多見(jiàn)于男性，2015年我國(guó)膀胱癌全年新發(fā)病例在男性患者中約為6.2萬(wàn)例，發(fā)病率8.83/10萬(wàn)[1，2]。而膀胱尿路上皮癌（urothelial carcinoma of bladder，UCB）是最常見(jiàn)的，約占總病例的90.0%以上[3]。近年來(lái)，盡管治療水平不斷提升，但是該腫瘤容易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，患者的預(yù)后并沒(méi)有得到明顯的改善。目前，雖然外科手術(shù)、化療以及免疫治療是膀胱癌的主要治療方式，但尚缺少有效的標(biāo)志物進(jìn)行診斷、惡性程度判斷以及預(yù)后分析。已有研究證明，腫瘤的發(fā)生需要新生血管為其提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，新生血管在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用[4]。目前已知促進(jìn)血管生成作用最強(qiáng)的一類(lèi)因子是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular epidermal growth factor， VEGF），它可以通過(guò)和特異性的受體結(jié)合，從而激發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)血管生成[5]。而ERG是研究者們近年來(lái)關(guān)注的熱點(diǎn)蛋白，它是ETS（E26transformation-specific）的一種同源基因，位于21號(hào)染色體q22，在多種腫瘤細(xì)胞中均有所表達(dá)[6，7]。已有研究證明，ERG蛋白在急性髓性白血病、尤文氏瘤、前列腺癌、血管源性腫瘤等腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平增高[8]。微血管密度是血管生成活性或強(qiáng)度的定量指標(biāo)之一。因此本研究通過(guò)探討ERG、微血管密度與臨床病理特征之間的關(guān)系，從而為研究膀胱尿路上皮癌血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2015年5月至2020年3月在該院泌尿外科住院手術(shù)治療的膀胱尿路上皮癌患者共502例，所有患者臨床、病理以及隨訪材料完整。其中376例為男性，126例為女性;年齡范圍16-92歲。腫瘤分期（TNM，2017版）：I期223例，II期178例，III期88例，IV期13例（詳見(jiàn)表1）。所有組織樣本均經(jīng)過(guò)4%甲醛溶液固定后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片和HE染色。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑

ERG兔抗人單克隆抗體（克隆號(hào)MXR004，EDTA熱修復(fù)）、VEGF兔抗人單克隆抗體（克隆號(hào)VG1）、免疫組化試劑盒、DAB顯色劑均購(gòu)買(mǎi)于福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色與結(jié)果判讀

將膀胱尿路上皮癌患者石蠟標(biāo)本分為非浸潤(rùn)性尿路上皮癌和浸潤(rùn)性尿路上皮癌兩組，分別進(jìn)行ERG蛋白和VEGF蛋白免疫組織化學(xué)染色。兩者均需經(jīng)過(guò)脫蠟水化、抗原修復(fù)、封閉內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶、抗體雜交顯色、復(fù)染、脫水、透明和封片一系列操作步驟完成。結(jié)果判讀由至少兩位高年資病理醫(yī)師依照獨(dú)立、雙盲準(zhǔn)則進(jìn)行閱片。VEGF蛋白以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色、棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性表達(dá);ERG蛋白以細(xì)胞核出現(xiàn)黃色、棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)。采取二次計(jì)分方法對(duì)染色結(jié)果實(shí)施半定量判讀。

1.2.3 微血管密度計(jì)數(shù)

免疫組化切片中棕色細(xì)顆粒狀為細(xì)胞陽(yáng)性信號(hào)，將棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞認(rèn)定為微血管。先使用100倍的顯微鏡觀察整張切片，找出其中微血管較為密集的部位，之后使用200倍顯微鏡分別觀察并記錄3個(gè)視野下染色的微血管數(shù)量，并計(jì)算它們的平均數(shù)，將該數(shù)值作為評(píng)估微血管密度的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 23.0軟件，通過(guò)x2檢驗(yàn)分析ERG與臨床病理特征之間的關(guān)系，通過(guò)t檢驗(yàn)分析微血管密度與臨床病理特征之間的關(guān)系。P<0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱尿路上皮癌中ERG和VEGF的表達(dá)

ERG陽(yáng)性表達(dá)為棕褐色顆粒，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞核，腫瘤細(xì)胞未見(jiàn)著色（見(jiàn)圖1）。膀胱非浸潤(rùn)性尿路上皮癌和浸潤(rùn)性尿路上皮癌組織中ERG蛋白高表達(dá)率分別為6.5%和63.4%，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（見(jiàn)表2）。

VEGF陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色顆粒，主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，部分血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)也可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)（見(jiàn)圖1）。膀胱非浸潤(rùn)性尿路上皮癌和浸潤(rùn)性尿路上皮癌組織中VEGF蛋白高表達(dá)率分別為12.0%和60.4%，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（見(jiàn)表2）。

2.2 膀胱尿路上皮癌中ERG和微血管密度的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)不同臨床病理特征下ERG蛋白的表達(dá)水平以及微血管密度平均數(shù)。結(jié)果顯示ERG蛋白表達(dá)與性別差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），ERG蛋白表達(dá)與腫瘤分級(jí)、腫瘤分期、淋巴結(jié)分期和TNM分期之間均存在顯著差異（P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（詳見(jiàn)表3）。微血管密度與性別差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），微血管密度表達(dá)與腫瘤分級(jí)、腫瘤分期、淋巴結(jié)分期和TNM分期之間均存在顯著差異（P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（詳見(jiàn)表3）。因此，ERG蛋白和微血管密度對(duì)腫瘤侵襲發(fā)展均具有重要意義。

3 討論

膀胱癌已成為世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)腫瘤，膀胱癌中最常見(jiàn)的病理類(lèi)型就是膀胱尿路上皮癌[9]。有研究證明，膀胱尿路上皮癌的發(fā)病過(guò)程是一個(gè)多基因、多因素相互作用的過(guò)程，主要危險(xiǎn)因素包括吸煙、飲食、感染以及職業(yè)暴露等等[10]。目前膀胱鏡活檢和尿液脫落細(xì)胞學(xué)檢查是主要的診斷方式，除此之外，還有一些腫瘤標(biāo)記物可以進(jìn)行輔助診斷。在治療上，手術(shù)切除仍然是主要的治療方式，但是由于膀胱尿路上皮癌的生長(zhǎng)特性，術(shù)后容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此探索早期能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)、診斷、和治療尿路上皮癌的研究越來(lái)越引起了大家的重視。

本研究使用免疫組化的方法檢測(cè)ERG蛋白和VEGF蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)水平，通過(guò)對(duì)502例膀胱尿路上皮癌組織中ERG和VEGF蛋白的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)ERG和VEGF蛋白在膀胱浸潤(rùn)性尿路上皮癌中的表達(dá)高于非浸潤(rùn)性尿路上皮癌，證明ERG和VEGF都可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)浸潤(rùn)。已有研究證實(shí)，VEGF在多種腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)，VEGF作為一種血管內(nèi)皮因子，可以促進(jìn)血管內(nèi)皮的遷移和增殖，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)自分泌或旁分泌VEGF促進(jìn)血管生成，而且VEGF的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期等均密切相關(guān)。因此本研究主要關(guān)注ERG蛋白和微血管密度及臨床病理特征的關(guān)系。

ERG屬于ETS轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員，它含有共保守的DNA結(jié)合域，同時(shí)也是內(nèi)皮細(xì)胞分化的標(biāo)志。已有研究表明，ERG蛋白在前列腺癌中高表達(dá)是由于ERG與雄激素調(diào)節(jié)跨膜絲氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）發(fā)生了融合，形成TMPRSS2-ERG融合基因[11]。同時(shí)ERG可以調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和新生血管形成，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中可以強(qiáng)烈表達(dá)，目前是血管源性腫瘤的高度敏感和特異的標(biāo)記物中的一種。

通過(guò)分析ERG蛋白和微血管密度分別與臨床病理特征之間關(guān)系，證明ERG蛋白和微血管密度與性別未見(jiàn)顯著差異（P>0.05），與腫瘤分級(jí)、腫瘤分期、淋巴結(jié)分期以及TNM分期均具有顯著差異（P<0.05），從而證明ERG蛋白和微血管密度可以提示腫瘤是否具有高侵襲性。而ERG蛋白和微血管密度呈正相關(guān)（P<0.05），說(shuō)明ERG蛋白表達(dá)程度越高，微血管密度就會(huì)越大。

Miettinen等在2011年首次報(bào)道ERG蛋白可以表達(dá)于血管內(nèi)皮腫瘤、上皮來(lái)源腫瘤和其他非上皮性腫瘤，在血管內(nèi)皮來(lái)源腫瘤中均陽(yáng)性表達(dá)，96%血管肉瘤、97.7%上皮樣血管內(nèi)皮瘤和所有的卡波西肉瘤中ERG均陽(yáng)性表達(dá)[12]。而ERG蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)以及與臨床病理特征的關(guān)系報(bào)道較少，有研究曾指出，ERG蛋白可以表達(dá)于高級(jí)別膀胱尿路上皮癌中伴有肉瘤樣分化的梭形腫瘤細(xì)胞，而其它類(lèi)型均為陰性[13]。根據(jù)2016版WHO泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)，浸潤(rùn)性尿路上皮癌可以伴有不同分化，包括巢狀型、巨細(xì)胞型、未分化型、肉瘤樣型、腺樣分化型、鱗狀分化型、合體細(xì)胞分化型等等，在本研究502例病例中，浸潤(rùn)性尿路上皮癌有227例，其中僅見(jiàn)到腺樣分化、鱗狀分化、合體細(xì)胞分化和巨細(xì)胞分化，這些病例中ERG蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)為陰性，由于亞型病例占比較少，因此未進(jìn)行下一步研究，在今后的工作中，可以多收集不同亞型的膀胱尿路上皮癌，分析其ERG蛋白表達(dá)和微血管密度與臨床病理特征的關(guān)系，同時(shí)ERG和VEGF之間的相關(guān)性分析也將列為后續(xù)研究的項(xiàng)目。

綜上所述，通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)ERG定位于膀胱尿路上皮癌的血管內(nèi)皮細(xì)胞，ERG高表達(dá)可以提示腫瘤的浸潤(rùn)生長(zhǎng)和高侵襲性，同時(shí)ERG有望成為靶向治療膀胱尿路上皮癌的新靶點(diǎn)。臨床中可將ERG和微血管密度聯(lián)合應(yīng)用，有助于判斷膀胱尿路上皮癌侵襲能力以及預(yù)后評(píng)估，均具有極大的臨床價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

〔1〕He Y T， Li D J， Liang D， Zheng R S， Zhang S W， Zeng H M， Chen W Q， He J. [Incidence and mortality of bladder cancer in China， 2014][J]. Zhonghua zhong liu za zhi [Chinese journal of? oncology]，2018，40（09）：647-652.

〔2〕鄭榮壽，孫可欣，張思維，等.2015年中國(guó)惡性腫瘤流行情況分析[J].中華腫瘤雜志，2019，41（01）：19-28.

〔3〕Zhang H， Guo Y， Song Y， et al. Long noncoding RNA GAS5 inhibits malignant proliferation and chemotherapy resistance to doxorubicin in bladder transitional cell carcinoma[J]. Cancer chemotherapy and pharmacology， 2017， 79（01）： 49-55.

〔4〕Zetter B R. The scientific contributions of M. Judah Folkman to cancer research[J]. Nature Reviews Cancer， 2008， 8（08）： 647-654.

〔5〕Kuo K C， Esposito F， McEntire J E， et al. Nucleoside profiles by HPLC-UV in serum and urine of controls and cancer patients[M]//Human Tumor Markers. De Gruyter， 2019： 519-544.

〔6〕Graves BJ， Petersen JM. Specificity within the ets family of transcription factors. Adv Cancer Res. 1998;75：1-55.

〔7〕Sharrocks AD， Brown AL， Ling Y， et al. The ETS-domain transcription factor family. Int J Biochem Cell Biol. 1997;29：1371-1387.

〔8〕Adamo P，Ladomery MR.The oncogene ERG： a key factor in prostate cancer[J]. Oncogene，2016，35（04）：403-414.

〔9〕Rebecca L. Siegel MPH， Kimberly D. Miller MPH，Ahmedin Jemal DVM， PhD. Cancer statistics， 2015[J]. CA： A Cancer Journal for Clinicians，2015，65（01）：5-29.

〔10〕Neal D. Freedman， Debra T. Silverman， Albert R. Hollenbeck， Arthur Schatzkin， Christian C. Abnet. Association Between Smoking and Risk of Bladder Cancer Among Men and Women[J]. JAMA： The Journal of the American Medical Association， 2011，306（07）：737-745.

〔11〕Esgueva R， Perner S， LaFargue CJ， et al. Prevalence of TMPRSS2-ERG and SLC45A3-ERG gene fusions in a large prostatectomy cohort. Mod Pathol. 2010; 23（06）：539-546.

〔12〕Mierrinen M， Wang Z F， Paetau A， et al.ERG transcription factor as an immmunohistochemical marker for vascular endothelial tumors and prostatic carcinoma[J]. Amerincan Journal of Surgical Pathology， 2011，35（03）：432.

〔13〕Yaskiv Oksana， Rubin Brian P， He Huiying， Falzarano Sara， Magi-Galluzzi Cristina， Zhou Ming. ERG protein expression in human tumors detected with a rabbit monoclonal antibody[J]. American Journal of Clinical Pathology， 2012，138（06）：803-810.

收稿日期：2021-10-06

基金項(xiàng)目：赤峰市自然科學(xué)科研課題（SZR21125）;內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目（NJZZ18202）

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