血管內皮生長因子基因rs699947位點多態性與漢族女性乳腺癌易感性的相關性

夏廣韜 俞 潔 劉宇飛 鄭立紅 裴耘婕 張 龍 隋 茹 張明龍▲

1.齊齊哈爾醫學院精神衛生學院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫學院遺傳學教研室，黑龍江齊齊哈爾161006；3.齊齊哈爾醫學院基礎醫學院，黑龍江齊齊哈爾 161006

乳腺癌是威脅女性健康的最常見的惡性腫瘤，其發病機制至今尚未完全清楚，多項研究表明乳腺癌的發生機制與遺傳易感基因的突變密切相關[1-2]，而單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）則是在進化中基因突變所導致遺傳差異的主要形式，也是疾病易感性、藥物敏感性等生物性狀差異的重要遺傳學基礎[3]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為一種主要的血管生成因子，能夠促進血管內皮細胞的增殖、分化，增加血管對大分子物質的通透性[4]。已有研究表明，VEGF 多態性可能影響VEGF 水平和活性，從而影響患乳腺癌在內的各種癌癥的風險[5-8]。基于此，本研究選取VEGF 基因的rs699947 位點，分析其與漢族女性乳腺癌發病之間的關聯性，以期為乳腺癌的防治、診斷和個體化治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年3月至2018年8月黑龍江省大慶油田總醫院、齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院、齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院以及齊齊哈爾建華醫院收治的258 例乳腺癌患者作為乳腺癌組，選取同期162 例健康女性作為對照組。乳腺癌組納入標準：①女性患者，均為漢族，診斷年齡為18～70 歲；②經病理學檢查明確診斷為乳腺癌，雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）情況明確；③無合并其他部位原發性腫瘤。對照組納入標準：①健康個體，無腫瘤及癌前病變患者；②非病毒性肝炎、艾滋病患者。所有樣本的采集和臨床資料的獲取均符合各醫院和醫學院的醫學研究倫理委員會的要求，所有研究對象均已簽署知情同意書。對乳腺癌組和對照組的基本特征信息進行采集，包括年齡、絕經史和腫瘤家族史，同時對乳腺癌的臨床生物學特性資料進行統計，包括乳腺癌患者的腫瘤大小（T1～T4）、腫瘤分期（G1～G3）和淋巴結轉移史（表1）。

表1 樣本基本特征信息[n（%）]

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取和PCR 抽取對照組和乳腺癌組外周血2 ml，置于枸櫞酸鈉抗凝管中，-80℃條件下儲存。采用小量全血基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，采用Nano500 微量核酸分析儀（杭州奧盛儀器有限公司）對DNA 的純度和濃度進行檢測，以保證后續PCR 反應檢測的質量需要。PCR：采用Sta 等[9]報道的方法對VEGF 基因rs699947 位點進行檢測，引物序列（北京華大蛋白質研發中心有限公司）：通用正向引物：5'-CTAGTGCACGAATGATGGAAAGG-3'，野生型基因（C）引 物F：5'-TCAGTCTGATTATCCACCCAGATCT-3'，突變型基因（A）引物5'-TCAGTCTGATTATCCAC CCAGATCG-3'，擴增產物大小295 bp。PCR 反應體系（20 μl）：50 ng DNA 模板（2 μl），正、反向引物各1 μl，Buffer 2 μl，MgCl 2 μl，Taq 酶1 U（0.2 μl），dNTP mixture 2 μl，加純化水至20 μl；PCR 熱循環參數：95℃預變性5 min，循環內95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共循環35 次，72℃進一步延伸5 min，野生型和突變型基因的擴增條件均一致。

1.2.2 基因分型 同一DNA 樣本需分別進行兩次PCR，以分別擴增可能檢出的野生型和（或）突變型基因，采用1.5%瓊脂糖凝膠（上海默璽生物科技有限公司）電泳對PCR 產物進行電泳，以在295 bp 處是否出現條帶作為判定標準，若兩次PCR 反應的產物均為295 bp，則該樣本基因型為AC，若單一PCR 反應產物為295 bp，則該樣本基因型為AA 或CC。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數資料用率表示，兩組間比較采用χ2檢驗；兩組的Hardy-Weinberg 定律檢驗采用擬合優度χ2檢驗； 采用logistic 回歸分析各基因型和不同遺傳模型與乳腺癌遺傳易感的相關性，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組間的均衡性檢驗和Hardy-Weinberg 定律檢驗

對乳腺癌組和對照組的基本特征信息進行均衡性檢驗，結果顯示：乳腺癌組的絕經比例高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；乳腺癌組有腫瘤家族史比例高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組的初潮年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）。兩組的Hardy-Weinberg 定律檢驗結果顯示： 兩組基因型分布的觀察值與期望值比較，差異無統計學意義（χ2乳腺癌組=2.674，χ2對照組=3.629，P＞0.05），表明本研究選取的研究對象符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，符合群體遺傳學研究的要求。

2.2 兩組VEGF 基因rs699947 多態性與乳腺癌易感性分析

兩組的rs699947 位點的等位基因頻率、 基因型頻率分布和不同遺傳模型的比較分析以及風險預測見表2，結果顯示：兩組的等位基因和基因型分布比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。對年齡、絕經與否和腫瘤家族史等因素予以校正后，攜帶基因型AC 和AA 的個體發生乳腺癌的風險分別為0.341（P＜0.05）和0.170（P＜0.05）。校正相關混雜因素后，兩組的顯性模型（AA+AC/CC）和隱性模型（CC/AC+AA）比較，差異有統計學意義（P＜0.05），顯性模型和隱性模型下對乳腺癌的風險預測值分別為0.276 和2.657（P＜0.05）。

表2 VEGF 基因rs699947 位點等位基因和基因型分布及不同遺傳模式下對乳腺癌易感性的風險預測

2.3 乳腺癌組VEGF 基因rs699947 多態性與臨床生物學特性的關系

rs699947 位點的基因型分布與腫瘤分期、淋巴結轉移陽性率、腫瘤大小、雌、孕激素受體陽性率和組織病理分型無明顯相關性（P＞0.05）（表3）。

表3 乳腺癌組患者VEGF 基因rs699947 多態性與乳腺癌生物學特性的關系

3 討論

VEGF 基因可通過多種機制促進血管的生成，已被證明在腫瘤發生、 發展和預后中起著關鍵作用[10]，有研究報道VEGF 在乳腺癌中過度表達[11-12]與微血管密度增加和乳腺癌復發有關[13]，并且VEGF 基因單核苷酸多態性可以通過影響蛋白表達，進而影響腫瘤的易感性和嚴重程度[14]。Rahoui 等[15]對摩洛哥女性的研究結果發現A 等位基因攜帶者降低了患乳腺癌的風險，而Jacobs 等[16]已經證明C 等位基因與美國人群中浸潤性導管癌的風險增加有關，但與原位癌或整體乳腺癌無關；與之矛盾的是，Kapahi 等[17-19]的研究顯示，AA 基因型與北印度人群、 伊朗人群和沙特阿拉伯人群乳腺癌的發病風險增高有關，Sa 等[20-21]對巴基斯坦人群和西班牙人群的研究發現，血管內皮生長因子基因多態性與乳腺癌的關聯不大。基于以上研究結果分析，VEGF 基因rs699947 位點多態性在世界范圍內的不同人種和群體中存在著差異。基于此，本研究探討VEGF 基因rs699947 位點多態性與漢族女性群體乳腺癌易感性的關系，結果顯示VEGF 基因rs699947位點的多態性分布與乳腺癌易感性明顯相關，且攜帶AA 和AC 基因型的個體患乳腺癌的風險分別降低0.170 倍和0.341 倍。本研究采用不同遺傳模型進行驗證，證實rs699947 的多態性與乳腺癌易感性相關聯，顯性模型的結果表明攜帶AA 和AC 基因型是攜帶CC 基因型個體發病風險的0.276 倍； 而與此相對應的隱性模型的結果表明攜帶CC 基因型是攜帶AC/AA 基因型個體發病風險的2.657 倍。因此，可以認為攜帶AC 和AA 基因型能夠降低乳腺癌的發病風險，是乳腺癌易感性的保護性因素之一。

為進一步研究rs699947 位點多態性與乳腺癌發展和預后間的關聯，本研究將rs699947 位點的基因型分布與乳腺癌的臨床生物學特性進行比較，結果顯示基因型分布與腫瘤分期和大小、乳腺癌淋巴結轉移以及雌、孕激素受體陽性率等乳腺癌生物學特征均不具有相關性，說明rs699947 位點多態性與乳腺癌的發展和預后無明顯關聯。

本研究尚存在一些不足：首先，本研究的人群均為漢族，由于不同研究人群可能有不同的遺傳背景及生活方式，因此rs699947 位點多態性對乳腺癌易感性的影響可能在世界范圍內存在較大差異； 其次，納入分層分析的患者數量不足，有待于更大樣本納入，結果可能會更顯著；最后，本研究只納入了rs699947一個多態性位點，沒有考慮位于其他基因與其連鎖的多態性位點，不排除與之連鎖的多態位點共同作用影響乳腺癌的發病。

綜上所述，VEGF 基因rs699947 多態性與乳腺癌的易感性具有顯著關聯，基因型AC 和AA 是乳腺癌發病的保護因素。這些發現為根據SNP rs699947 基因型評估乳腺癌發病風險提供前期研究數據，有望為個體化醫療打下基礎。