骨橋蛋白對胃癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響

覃月超 袁小林 曲范杰

1.大連市第三人民醫院腫瘤科，遼寧大連 116033；2.大連大學附屬中山醫院中心實驗室，遼寧大連 116011

胃癌是常見的惡性侵襲性腫瘤之一，其在全球惡性腫瘤中發病率和死亡率均較高[1]。盡管目前有根治性手術切除和輔助治療等手段，但其預后仍然很差，因此，探索胃癌相關基因及其作用機制對于胃癌的靶向治療和改善胃癌患者的預后具有重要的意義[2-4]。近年來，研究發現骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種細胞外基質蛋白，在各種惡性腫瘤中過表達，并參與多種細胞進程，如增殖、侵襲、轉移和血管生成[5-7]。本研究中沉默OPN 在胃癌細胞SGC-7901 中表達，探究OPN 對胃癌SGC-7901 細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響，并探究所涉及的相關蛋白，以期為OPN 作用于胃癌機制的深入研究和胃癌的靶向治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞、干擾載體 胃癌SGC-7901 細胞系：購自上海細胞保藏中心。NC-shRNA 陰性對照載體和OPN-shRNA 載體構建于上海生工生物公司。

1.1.2 試劑與儀器 RPMI-1640（HYclon 公司，貨號：AC10210670），胎牛血清（天津灝洋生物制造有限公司，貨號：20101020），UltraFectinTM 轉染試劑（上海源培生物科技股份有限公司，貨號：1692499），Matrigel基質膠（BD 公司，貨號：6095004），OPN 一抗、β-actin內參（Abbkine 公司，貨號：Abp52084、A01010），cyclin D1 一抗、VEGF 一抗、基質金屬蛋白酶2（matrix metallo proteinase 2，MMP-2）一抗（北京博奧森生物科技有限公司，貨號：bs-0623R、bs-0729R、bs-4599R），倒置顯微鏡（Leica Microsystem，型號：DM IL 三目）；伯樂Bio-rad 垂直電泳系統（BIO-RAD Laboratories，型號：1658033）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SGC-7901 細胞在含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素一鏈霉素的RPMll640 培養基，37℃5%CO2培養箱中培養，細胞生長約90%時，用0.25%胰酶以1∶3 進行傳代，細胞培養至第三代可用于后續的實驗。

1.2.2 分組處理 control 組：不做處理的SGC-7901 細胞；NC-shRNA 組：轉染表達與OPN 基因序列無同源性的載體，排除轉染試劑，干擾載體合成方法對細胞的影響；OPN-shRNA 組：轉染OPN 載體來沉默細胞中OPN 的表達。

1.2.3 細胞轉染 轉染前一天，將SGC-7901 細胞接種于6 孔板中，置于37℃5%CO2培養箱中培養至80%融合度，按照試劑說明書進行操作將載體轉染到細胞中，轉染后6 h 換液，轉染后24 h 或48 h 用于后續實驗。

1.2.4 MTT 細胞增殖實驗 各組細胞濃度均調整為2.5×105/ml，取200 μl 各組細胞懸液分別接種于96孔板中，每組5 個復孔，于培養箱中培養0、24、48、72 h和96 h 后加入MTT 溶液20 μl，繼續培養4 h 后吸出溶液，加入DMSO 在搖床中平搖10 min，隨后在490 nm 波長下測定孔內吸光值（OD 值）。

1.2.5 Transwell 侵襲遷移實驗 用RPMl 1640 以1∶40的比例稀釋基質膠，取50 μl 加入到transwell 小室中鋪膠，放入培養箱中孵育4～6 h，調整細胞濃度為4×105/ml，取100 μl 細胞懸液加入到上室中，24 孔板下室加入500 μl 含10%胎牛血清的培養基，培養48 h后。4%多聚甲醇固定細胞30 min，1%結晶紫溶液染色20 min，倒置顯微鏡下觀察，隨機選取5 個視野計數并拍照。進行遷移實驗時，上室無需鋪基質膠，培養24 h，其余步驟和侵襲實驗相同。

1.2.6 蛋白免疫印跡實驗（Western blot）采用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA 法進行蛋白濃度測定，采用10%SDS-PAGE 電泳分離蛋白，隨后轉膜、封閉、一抗（1∶2000）孵育4℃過夜、洗膜、二抗（1∶5000）孵育1 h、洗膜，使用ECL 發光液進行顯影。將β-actin 蛋白表達作為內參，使用Image J 軟件分析蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0 對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 沉默OPN 對SGC-7901 細胞增殖的影響

control 組和NC-shRNA 組細胞增殖速率比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。OPN-shRNA 組細胞增殖速率低于control 組，差異有統計學意義（P ＜0.01）。見圖1。

圖1 OPN 沉默對SGC-7901 細胞增殖的影響

2.2 沉默OPN 對SGC-7901 細胞侵襲性的影響

control 組和NC-shRNA 組細胞侵襲和遷移能力比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；OPN-shRNA 組細胞侵襲和遷移能力低于control 組，差異有統計學意義（P ＜0.01）。見圖2。

圖2 沉默OPN 對SGC-7901 細胞侵襲性的影響

2.3 沉默OPN 對SGC-7901 細胞cyclinD1、VEGF 和MMP-2 蛋白表達的影響

control 組 和NC-shRNA 組cyclinD1、VEGF 和MMP-2 蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；OPN-shRNA 組cyclinD1、VEGF 和MMP-2 蛋白表達水平低于control 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 沉默OPN 對SGC-7901 細胞cyclinD1、VEGF和MMP-2 蛋白表達的影響

3 討論

OPN 在多種癌癥中具有促進癌細胞的黏附、增殖、侵襲、轉移和血管生成等作用[5,8-15]。但是OPN 在胃癌細胞中的生物學作用仍不明確，需要做進一步的探索。本研究采用多種實驗方法研究OPN 在胃癌SGC-7901 細胞中的作用，發現降低胃癌細胞中OPN 的表達后，SGC-7901 細胞的增殖、侵襲和遷移能力減弱，其cyclinD1、VEGF 和MMP-2 蛋白表達水平也有所下降。

OPN 的過表達與癌癥患者的一些臨床病理特征有關，如高增值指數、淋巴結和血管浸潤及遠處轉移，因此OPN 的過度表達可作為癌癥患者預后不良和腫瘤復發的一項獨立的預后指標[16]。研究報道，敲低OPN 在卵巢癌SKOV-3 和OVCAR-3 細胞中的表達，能夠顯著降低卵巢癌細胞的增殖[17]。將siRNAOPN SGC-7901 細胞注射到小鼠體內，發現OPN 下調抑制小鼠體內腫瘤的生長和轉移，提高小鼠的存活率[18]。本研究使用OPN 特異性shRNA 下調OPN 的表達，在有效地沉默了OPN 基因后，本研究觀察到SGC-7901細胞增殖、侵襲和遷移能力降低。結合之前的研究報道，可以推測出OPN 在胃癌細胞中處于過表達狀態，并促進癌細胞的發生發展過程。為了探討OPN 是如何調節胃癌細胞系的增殖、侵襲和遷移能力的，本研究采用Western blot 實驗檢測OPN shRNA 干擾前后SGC-7901 細胞相關蛋白水平變化情況，結果發現沉默OPN 基因表達后，SGC-7901 細胞的cyclin D1、MMP-2 和VEGF 蛋白表達水平均下降。細胞周期失調是細胞惡性增殖的機制之一，cyclin D1 蛋白對細胞周期的調控起著重要作用，cyclin D1 蛋白過表達導致乳腺癌細胞異常增殖以及促進乳腺癌的發生[19]。OPN激活后的信號傳導可以促進MMP-2 等基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase 2，MMPs）的蛋白水解酶的表達，MMPs 與黏附分子結合并降解細胞外基質成分，從而促進癌細胞的運動，且MMP-2 可降解Ⅳ膠原和Ⅴ膠原，進一步增強腫瘤細胞消化血管基底和組織屏障的能力，最終促進腫瘤細胞侵襲和遷移[20-21]。在體內實驗發現，VEGF 和OPN 在腫瘤血管生成中起著協同作用，增強腫瘤細胞進入循環的能力，最終促進腫瘤向其他器官的侵襲和轉移[22]。此外，研究發現OPN通過調節uPA，MMP-2 和MMP-9 蛋白來提高癌細胞的侵襲轉移能力[23-24]。VEGF 通過自分泌機制上調癌細胞的MMP-9 表達,從而促進肝癌和黑色素瘤的浸潤轉移[25-26]。本研究結果提示OPN 通過激活某些信號傳導通路調節cyclin D1、MMP-2 和VEGF 的表達，從而促進胃癌細胞系的增殖、侵襲和遷移。

本研究只是在細胞水平上研究OPN 對胃癌的作用，具有一定的局限性，體內實驗研究和臨床應用研究是未來我們努力的一個方向。

綜上所述，本研究提示OPN 能增強胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，其作用機制與cyclin D1、VEGF和MMP-2 蛋白的表達相關，但其具體調控機制還需做進一步的研究。