基于核酸適配體檢測食源性致病菌的研究進展

董 蕾，黃利華

（廣州城市職業(yè)學院食品科學與美食養(yǎng)生學院，廣東 廣州 510640）

全球食品安全問題以食源性致病菌導(dǎo)致的疾病為問題之首。根據(jù)WHO統(tǒng)計顯示，每年全球所發(fā)生的食源性疾病可達數(shù)10億起。僅因為食物所引起的腹瀉性疾病導(dǎo)致的死亡人數(shù)每年就可達220萬人[1]。食源性致病菌通過污染食品，引起人類疾病，常見的致病菌包括金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、致病性大腸桿菌（尤以出血性大腸桿菌O157:H7為主）、致病性弧菌、志賀氏菌等。這些致病菌污染食品后，會引起食品腐敗變質(zhì)或代謝產(chǎn)生毒素，引起人畜患病。

傳統(tǒng)食源性致病菌檢測方法包括平板分離法[2]、分子生物學方法[3-5]、免疫學方法[6]等。但傳統(tǒng)檢測技術(shù)檢測周期長、靈敏度不高、技術(shù)要求高；分子生物學技術(shù)則要求技術(shù)條件高、檢測易出現(xiàn)假陽性結(jié)果；免疫學檢測方法的前期抗體制備周期長、研發(fā)成本高，均不能很好滿足食源性致病菌快速、靈敏、特異的檢測需求[7]。在適配體發(fā)現(xiàn)以后，通過適配體與不同技術(shù)的結(jié)合，使食源性致病菌檢測方法步入新階段。本文主要從核酸適配體的特征以及在不同領(lǐng)域，尤其是食源性致病菌檢驗方面的應(yīng)用作簡要概述。

1 適配體的特點

1990年，Tuerk等發(fā)現(xiàn)一類能夠與蛋白結(jié)合，產(chǎn)生高特異性和親和度的單鏈核酸序列，將其定名為適配體（Aptamer）[8]。適配體是一段特異的單鏈DNA或RNA，通過獨特的空間結(jié)構(gòu)，可以實現(xiàn)高特異性識別和高親和性的結(jié)合靶物質(zhì)。由于適配體的靶物質(zhì)可以為生物分子、化學分子及細胞，且探針具有分子量小、無免疫原性、修飾簡單等優(yōu)點[9][10]，故自從發(fā)現(xiàn)以來，涌現(xiàn)出大量針對不同靶物質(zhì)的適配體研究，搭載在不同的材料上制成各種生物傳感器，廣泛應(yīng)用于藥物生產(chǎn)、醫(yī)學檢測、活體成像等領(lǐng)域[11]。

適配體通常含有15-40個堿基，分子量為5-25kD。與抗體等傳統(tǒng)免疫檢測原件相比，適配體具有以下幾個特點：

（1）測環(huán)境要求不高、易做各種修飾：適配體為一類核酸物質(zhì)，片段小，性質(zhì)穩(wěn)定，因此能夠耐高溫、耐酸堿環(huán)境，且由于其片段小，易于保存，不易降解，同時可以在序列末端進行巰基、生物素或其他生物基團的標記，用以搭建各種生物傳感器。

（2）和性高、特異性強：由于適配體是單鏈的寡核苷酸DNA或RNA，可以形成各種空間構(gòu)象（如發(fā)卡結(jié)構(gòu)、口袋結(jié)構(gòu)、G-四聚體等），通過氫鍵、范德華力等作用與相應(yīng)的靶物質(zhì)形成穩(wěn)定的復(fù)合物[12]，這一類復(fù)合物的穩(wěn)定契合可以使解離常數(shù)達到nmol甚至pmol水平，因此具有高結(jié)合能力。

（3）選周期短：傳統(tǒng)免疫學檢測進行抗體篩選，需要經(jīng)過一系列體外篩選及動物實驗，實驗周期長。但適配體篩選過程不需要進行動物實驗，經(jīng)由最常見的適配體篩選技術(shù)──指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX），經(jīng)過8-15輪的篩選后，即可得到與靶物質(zhì)親和度高、特異性強的適配體，整個周期可控制在1-2個月。

（4）用范圍廣：適配體是一段包含15-40個堿基的隨機序列，用于進行適配體篩選的文庫容量巨大，因此靶物質(zhì)的范圍極廣，包括生物小分子、蛋白質(zhì)、細胞甚至完整細胞[13-16]。隨著研究者們的不斷深入和廣泛研究，僅以食品檢測為例，適配體現(xiàn)已在農(nóng)獸藥殘留[17-21]、重金屬[22-24]及食源性致病菌[25][26]等檢測中取得一定成績。

2 核酸適配體的應(yīng)用

近年來，隨著對適配體研究的不斷深入，適配體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、生物傳感、治療、微生物檢測、細胞成像分析等相關(guān)領(lǐng)域中[27]。

2.1 基礎(chǔ)研究領(lǐng)域

一般的，適配體用于進行生命進化方面的研究。應(yīng)用SELEX技術(shù)可以方便快捷的進行核酸方面的研究。如利用SELEX篩選核酶的特異性寡核苷酸適配體及其剪切位點，用于進行生物傳感材料的集成[28]。通過適配體的生物素標記、熒光素標記等化學修飾，再與蛋白質(zhì)結(jié)合，也可用于蛋白質(zhì)的細胞定位以及分離純化等基礎(chǔ)研究。

2.2 分析檢測領(lǐng)域

與抗體相比，適配體作為生物傳感器具有可重復(fù)利用性的優(yōu)勢，因此近年來基于適配體的生物分析模式迅猛發(fā)展。一般根據(jù)信號收集方式不同，可將適配體生物傳感器分為電化學傳感器、光學傳感器和質(zhì)量敏感傳感器。如Li等人利用適配體修飾金電極表面，從而建立利用電化學信號檢測凝血酶的方法，其檢測限可達到1pmol/L[29]；Song KM等人將適配體吸附于納米金表面，當適配體與目標物質(zhì)結(jié)合后，會從納米金表面脫離，引起納米金在鹽溶液中的聚集，溶液可由紅色變?yōu)樗{色，從而實現(xiàn)肉眼識別檢測卡那霉素，檢測限可達25nmol/L[30]。

2.3 食品安全檢測領(lǐng)域

食源性致病病菌的檢測是食品安全檢測中占比非常高的一部分，傳統(tǒng)食源性致病菌的檢測存在耗時長、技術(shù)要求高、前期研發(fā)或檢測成本等弊端，適配體的發(fā)現(xiàn)彌補了這些常規(guī)技術(shù)的不足。一般進行食源性致病菌的靶物質(zhì)篩選分為全細胞、表面組分以及毒素。已有較多研究對于大腸桿菌[31][32]、沙門氏菌[33-35]、金黃色葡萄球菌[36]、單增李斯特菌[37]等進行了適配體序列的篩選。同時，也有相關(guān)報道進行生物毒素的檢測，如Cruz-Aguado&Penner首次篩選赭曲霉毒素A（OTA）特異性適配體，并建立OTA適配體為識別模式的熒光偏振檢測技術(shù)[38]。

2.3.1 基于適配體的光學傳感器

熒光適配體生物傳感器利用熒光基團標記核酸適配體，當目標菌與適配體結(jié)合，產(chǎn)生熒光偏振或熒光強度的改變，進行食源性致病菌的檢測[39][40]；或?qū)晒饣鶊F或淬滅基團標記在適配體兩端，當目標均與適配體結(jié)合后，會引起適配體構(gòu)象發(fā)生改變，引起熒光信號差異[41]。當探針加入納米材料氧化石墨烯后，熒光探針由于吸附在氧化石墨烯上而導(dǎo)致熒光淬滅。當目標菌出現(xiàn)時，適配體與靶物質(zhì)結(jié)合，使熒光信號重新激發(fā)，通過對熒光信號的強弱進行測定，可實現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌的定量檢測，其檢出限為102CFU/ml。利用熒光適配體生物傳感器在沙門氏菌O8[42]、單增李斯特菌[43]、金黃色葡萄球菌[44]等均已有很好應(yīng)用。

2.3.2 基于適配體的電化學傳感器

電化學技術(shù)操作簡便、靈敏度高、成本低廉[45]。將適配體與電化學活性傳感原件固定于電極上，當加入靶物質(zhì)時，適配體與靶物質(zhì)結(jié)合會導(dǎo)致電極表面修飾物結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，通過檢測電化學信號或電流變化，即可實現(xiàn)目標菌的定性和定量檢測。目前，通過電化學傳感器檢測大腸桿菌O111[46]、大腸桿菌O55:B5[47]、葡萄球菌腸毒素B[48]等食源性致病菌或腸毒素已獲得成功。

2.3.3 基于適配體的壓電晶體傳感器

壓電晶體是一種非中心對稱晶體，在機械力夏可發(fā)生形變，帶電質(zhì)點發(fā)生相對位移，使晶體表面出現(xiàn)正、負束縛電荷，兩側(cè)的電勢差就可作為檢測信號。Ozalp等將能識別沙門氏菌的適配體修飾石英晶體微天平（QCM）傳感器上，當出現(xiàn)目標菌時，兩者結(jié)合會導(dǎo)致QCM傳感器發(fā)生形變，引起電勢差，檢出限為100CFU/ml[49]。

3 結(jié)語與展望

核酸適配體具有特異性強、穩(wěn)定性好、靈敏度高、親和力強、易于修飾等特點，能夠識別多種目標物，與納米金、熒光、電化學、流式、表面增強拉曼等技術(shù)相結(jié)合，可進一步提高檢測的靈敏度，降低檢測成本，縮短檢測時間，因此在食源性致病菌檢測中得到廣泛應(yīng)用。然而，適配體技術(shù)在食源性致病菌檢測相關(guān)技術(shù)依然存在適配體篩選效率低，高通量與多重同時檢測關(guān)鍵技術(shù)欠缺，相關(guān)儀器設(shè)備體型龐大、價格昂貴等瓶頸，難以滿足現(xiàn)場快速檢測需求。在未來的技術(shù)發(fā)展中，對于核酸適配體的篩選可以考慮基于石墨烯技術(shù)、細胞芯片技術(shù)或高保真適配體篩選技術(shù)，從而提高適配體的篩選效率；同時在檢驗檢測領(lǐng)域，核酸適配體可與環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)、重組酶介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)等相結(jié)合，降低檢測食源性致病菌的檢出限。