缺血時間差異對大鼠腸缺血再灌注損傷的影響研究

潘曉慧,張朋輝,江國健,李 娟,陳桂煌,姚欣伶,馮學軒

(廣東省醫(yī)學實驗動物中心,廣州 528248)

小腸缺血再灌注損傷(intestinal ischemiareperfusion injury,IIRI)主要是指由于腸道疾病或腸道外科手術等原因引起腸道缺血,在恢復血流供應時,產生大量的氧自由基,由于組織細胞內線粒體功能未恢復,對氧自由基清除能力不足,引起氧化應激壓力上升,導致細胞損傷,進而加速細胞凋亡[1-3]在臨床上表現(xiàn)為腸道功能紊亂和結構損傷、全身炎性反應綜合征、多器官功能衰竭等,最終可導致死亡,腸黏膜損傷且伴有腸系膜缺血的患者死亡率可高達59%～93%[4-5],其死亡率之高及預后不良使得IIRI 成為了臨床上研究的熱點。如何成功建立與臨床癥狀相一致的IIRI 模型,將有助于推動該類疾病的基礎研究,包括臨床癥狀研究及預后研究,也將有利于藥物干預研究。但目前針對IIRI 建模的研究較為薄弱,缺血時間對于IIRI 模型的成立起著至關重要的作用,缺血時間的長短決定了機體內自由基的多少及氧化應激壓力的高低,缺血時間過短未必能造成損傷,缺血時間過長會使組織直接在缺血期發(fā)生不可逆損傷甚至壞死,目前針對IIRI建模的研究較為薄弱,而缺血時間對于IRII 模型的成立起著至關重要的作用。因此,本實驗主要研究關鍵因素——缺血時間,對IIRI 模型建立的影響,并從發(fā)病機制、氧化損傷層面及組織病理學方面評價模型的適用性,為用于缺血再灌注損傷防治藥物的研發(fā)提供相應的模型工具及基礎數據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

24 只SPF 級SD 大鼠,雄性,體重221.2～230.6 g,購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心[SCXK(粵)2018-0002]。動物飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學實驗動物中心SPF級動物房[SYXK(粵)2018-0002],飼養(yǎng)溫度與濕度:20℃～26℃,40%～70%,采用10 h:14 h 晝夜間斷照明。動物自由進食和飲水,所有飼料和飲用水均由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。本實驗經廣東省醫(yī)學實驗動物中心動物倫理委員會批準(B202005-6),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉:批號P3761,德國默克生產;烏來糖:批號20171219,國藥集團化學試劑有限公司生產;氯化鈉注射液,批號:201207136,安徽豐原藥業(yè)股份有限公司淮海藥廠生產;SOD 試劑盒,批號:20210604,南京建成生物工程研究所生產;GSH-Px試劑盒,批號:20210603,南京建成生物工程研究所生產;MDA 試劑盒,批號:20210605,南京建成生物工程研究所生產;GSH 試劑盒,批號:20210605,南京建成生物工程研究所生產。

BS-3000A 電子分析天平,感量:0.1 g,上海友聲衡器有限公司生產;BSA224S 電子分析天平,感量:0.1 mg,賽多利斯科學儀器(北京)科技有限公司生產;KDC-2046 低速冷凍離心機:科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司生產;RM2135 輪轉切片機:德國LEICA 公司生產;ASP300S 生物組織全自動脫水機:德國LEICA 公司生產;EG1150 生物組織包埋機及冷凍機:德國LEICA 公司生產;CS-VI 攤片烤片機:湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司生產;AutoStainer-XL 生物組織全自動染色機:德國LEICA 公司生產;BX43 型生物顯微鏡:日本OLYMPUS 生產;CellSens Standard 顯微圖像軟件:日本奧林巴斯公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組

將24 只SD 大鼠檢疫結束后,根據體重隨機分為假手術組、缺血30 min 組、缺血1 h 組、缺血2 h組,6 只/組。

1.3.2 模型制備

按2 mL/kg 體重的劑量腹腔注射3%的戊巴比妥鈉溶液將SD 大鼠麻醉,先腹部剃毛備皮,之后仰臥位固定,于腹部正中,腹白線處開腹,分離腸系膜上動脈,用4 號手術線活結結扎根部使缺血,直至見腸系膜血管顏色變淺,即為缺血成功。動物按20 mL/kg 體重腹腔注射氯化鈉注射液進行補液在缺血開始及再灌注開始時,假手術組只分離腸系膜上動脈,不進行缺血再灌注。各實驗組缺血對應時間后,將活結解開,恢復供血4 h 后大鼠按60 mL/kg體重腹腔注射20%烏來糖溶液麻醉,腹主動脈采血后處死,取小腸進行氧化指標及組織病理學檢測。

1.3.3 指標檢測

(1)腸道組織大體剖檢觀察

大鼠大體剖檢肉眼觀察腸道變化。

(2)氧化指標檢測

取10%腸組織勻漿,按各試劑盒說明,測定SOD、GSH-Px 活性及MDA、GSH 含量。

(3)腸組織病理學觀察及腸組織損傷評分

動物安樂死后取小腸固定于4%中性甲醛固定液,進行常規(guī)石蠟切片,HE 染色觀察,并測量小腸絨毛高度及粘膜厚度,觀察炎癥細胞聚集情況并進行炎癥細胞浸潤情況評分,見表1。參照Chiu’s 6 級評分法對小腸組織進行半定量評分,見表2。

表1 炎癥細胞浸潤情況評分標準Table 1 Inflammatory cell infiltration scoring standard

表2 小腸組織損傷Chiu’s 評分量表Table 2 Intestinal tissue injury Chiu’s score

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 動物死亡情況

缺血2 h 組其中兩只大鼠缺血2 h 恢復供血后出現(xiàn)嚴重拉稀,并于缺血3 h 后死亡,剖檢發(fā)現(xiàn)小腸出血,瘀黑,死亡動物實驗結果未參與統(tǒng)計。

2.2 大體剖檢結果比較

假手術組小腸表面紅潤有光澤,回腸至盲腸處內容物成型;缺血30 min 組小腸輕微脹氣,內容物偏軟;缺血1 h 組肛門處可見稀便,小腸腸壁變薄,小腸內脹氣明顯,內容物呈黃色啫喱狀,偶見出血點;缺血2 h 組,拉稀嚴重,小腸內可見明顯出血,小腸腸壁變薄且全部腸段脹氣明顯,內容物呈紅色啫喱狀。

2.3 SOD、GSH-Px 活性及MDA、GSH 含量比較

與假手術組比較,缺血30 min 組和缺血1 h 組MDA 含量升高(P<0.05)(圖1A),缺血1 h 組SOD活性顯著升高(P<0.05)(圖1B),各缺血組GSH-Px活性升高(P<0.01)(圖1C),缺血30 min 組和缺血2 h 組GSH 含量降低(P<0.05)(圖1D)。

圖1 不同組別MDA、GSH 含量及SOD、GSH-Px 活性比較Figure 1 Comparison of MDA and GSH contents and SOD and GSH-Px activities in different groups

2.4 腸組織病理學結果比較

2.4.1 組織病變

假手術組小腸黏膜層、肌層完整,黏膜上皮細胞排列整齊、未見變性、壞死、炎癥,部分黏膜下層見淋巴小結,血管未見擴張、出血;缺血30 min 組小腸絨毛頂端上皮下間隙增寬、毛細血管淤血,黏膜層極少量炎細胞浸潤;缺血1 h 組小腸絨毛頂端上皮下間隙增寬或絨毛頂端部分破損、毛細血管淤血,個別樣本黏膜上皮細胞壞死、潰瘍、固有層破壞、固有層及黏膜下層血管淤血、出血,黏膜層極少量至輕度炎細胞浸潤;缺血2 h 組小腸黏膜上皮細胞壞死、潰瘍、固有層破壞、固有層及黏膜下層血管淤血、出血,黏膜層輕度炎細胞浸潤,見圖2。

圖2 不同組別小腸組織病理學變化情況(HE 染色)Figure 2 Histopathological changes of intestine in different groups(HE staning)

2.4.2 絨毛高度

與假手術組比較,缺血1 h 組、缺血2 h 組小腸絨毛高度降低,有統(tǒng)計學差異(P<0.01),見表3。

2.4.3 黏膜厚度

與假手術組比較,缺血1 h 組、缺血2 h 組小腸黏膜厚度減小,有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表3。

2.4.4 炎癥細胞浸潤情況評分

與假手術組比較,各缺血組小腸均有不同程度的炎癥細胞浸潤,且有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

2.4.5 Chiu’s 評分

與假手術組比較,各缺血組小腸均有不同程度的病理學改變,且有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

表3 腸組織病理學結果()Table 3 Intestinal histopathology results

表3 腸組織病理學結果()Table 3 Intestinal histopathology results

注:與假手術組相比,?P<0.05,??P<0.01。Note.Compared with the sham operation group,?P<0.05,??P<0.01.

3 討論

據報道,氧化應激、炎癥反應及繼發(fā)性細胞凋亡是小腸缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的重要病理機制[6-8]。小腸動脈缺血情況下,氧供給下降,導致氧自由基大量產生并激活炎癥因子,引起炎細胞在病灶上聚集[9-11],因此,不同缺血時間下機體的氧化應激水平以及小腸黏膜結構的改變及炎細胞浸潤程度能很好反映IIRI 的情況。以此為切入點,本研究從氧化水平和病理層面探討了IIRI 模型的建模條件。

在研究中發(fā)現(xiàn),短時間缺血情況下,氧自由基產物MDA 含量明顯升高,且升高幅度與缺血時間呈正相關,證明機體內已產生大量的自由基。MDA的急劇升高,正反饋調節(jié)抗氧化酶類SOD 和GSHPx 的產生,以抵抗體內的氧化應激壓力,使得SOD、GSH-Px 的產生呈現(xiàn)與MDA 相似的趨勢,因此可見在缺血1 h 時,模型動物MDA 含量和SOD、GSH-Px活性均高于缺血30 min,且與正常動物有顯著差異。另外,在實驗過程中發(fā)現(xiàn)缺血2 h 時,MDA 含量和SOD、GSH-Px 活性不升反降,結合病理結果和動物臨床表現(xiàn),我們得知,在缺血2 h 時,小腸病理損傷嚴重,上皮細胞壞死、潰瘍、固有層破壞,炎癥細胞浸潤明顯,小腸絨毛高度及黏膜厚度顯著降低,且損傷程度較缺血1 h 時要嚴重,且動物臨床狀態(tài)較差,個別動物腸道肉眼可見出血,出現(xiàn)了動物死亡的情況,正因此,機體對各項刺激的反應性下降,導致MDA 含量和SOD、GSH-Px 活性不升反降的結果出現(xiàn)。病理結果同時顯示,缺血30 min 及1 h 均可見小腸組織的病理變化,且變化程度與缺血時間呈正相關性,缺血1 h 更可見小腸絨毛高度及黏膜厚度明顯下降,但病變程度均弱于缺血2 h 組。

綜上所述可知,缺血30 min,IIRI 模型癥狀較輕,小腸絨毛高度及黏膜厚度未見明顯變化;缺血2 h,動物死亡率較高,且小腸病理損傷十分嚴重,不適用于IIRI 建模;缺血1 h,可見氧化指標明顯變化,MDA 含量顯著升高,同時小腸病理變化明顯,小腸絨毛高度、黏膜厚度顯著降低,炎性細胞輕度浸潤,可見IIRI 模型程度適中,相對理想,因此在IIRI疾病研究時,建議采用缺血1 h 再灌注4 h 的條件進行造模。