MTHFR基因多態性與急性淋巴細胞白血病患兒大劑量甲氨蝶呤血藥濃度和不良反應的相關性研究

李 琰，張文靚，姚 敏，吳小林（.山東省棗莊市婦幼保健院藥學部，山東 棗莊 7700；.山東省棗莊市婦幼保健院急診科，山東 棗莊 7700）

兒童急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是臨床常見且多發的兒童惡性腫瘤之一，占兒童急性白血病的75%～80%[1]。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是抗葉酸代謝藥物，大劑量甲氨蝶呤（high-dose methotrexate，HD-MTX）在ALL患兒的維持治療和髓外白血病的防治中發揮重要作用[2]。MTX在抵抗白細胞增殖的同時也會抑制人體正常細胞分裂，從而導致骨髓抑制、黏膜炎、肝損害等不良反應的發生[3]。亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是葉酸代謝途徑中的關鍵酶，目前研究較多的2個基因多態位點分別為MTHFR C677T和A1298C，其基因發生突變可增加ALL患兒MTX化療相關不良反應的發生[4-6]。本研究通過探討MTHFR C677T和A1298C基因多態性與ALL患兒MTX血藥濃度及不良反應的相關性，以期為MTX個體化治療提供參考。

1 資料和方法

1.1 病例選擇

回顧性收集2017年1月–2020年12月于我院確診為ALL，并采用CCCG-ALL-2015方案化療的65例兒童為研究對象。本研究經醫院倫理委員會批準（批件號：KY2019120614），所有受試者（患兒家長）均簽署知情同意書。

納入標準：①符合形態學、免疫學、細胞遺傳學和分子生物學分型及WHO 2008年關于ALL的診斷標準[7]；②經誘導緩解治療后處于完全緩解狀態；③重要臟器（心、肺、肝）功能正常。排除標準：①出現嚴重過敏反應者；②嚴重心、肺、肝腎功能不全者；③合并其他惡性腫瘤或因其他惡性腫瘤接受過HDMTX化療者；④因化療藥品不良反應或各種原因導致化療終止者。

1.2 藥品和儀器

甲氨蝶呤注射液（輝瑞制藥，規格：20 mL∶500 mg，批號：HM05A）；甲氨蝶呤檢測試劑盒（德國西門子公司）；DNA提取試劑盒（上海玉博生物科技有限公司）；MTHFR基因檢測試劑盒（上海百傲科技有限公司）。SimpliAMP聚合酶鏈反應儀（美國Life technologies公司）。BaiO BR-526-24全自動雜交儀（上海百傲科技有限公司）。

1.3 治療方法[8]

在臨床確定患兒血常規、肝腎功能正常，無感染狀態時開始進行HD-MTX化療。HD-MTX劑量為2～5 g·m-2。突擊劑量為MTX總量的1/6（不超過500 mg·次-1），于開始給藥30 min內快速靜脈滴注，此后23.5 h內均勻持續靜脈泵入。

1.4 MTX血藥濃度測定

分別于靜脈滴注HD-MTX后第24、48、72 h，采集患兒外周靜脈血2 mL置于無添加劑的采血管中，立即離心（3500 r·min-1，5 min），分離血清后采用酶放大免疫分析法檢測MTX血藥濃度。

1.5 不良反應評估

參照美國國立癌癥研究所常規毒性判定標準（第3版）評估在鞏固治療階段每次HD-MTX使用期間或使用后14 d內Ⅱ級及以上的MTX化療相關不良反應。

1.6 DNA提取及遺傳分析

提取患兒DNA后測定其濃度和光密度比（質量濃度范圍：30～40 ng·μL-1，光密度A260/A280范圍：1.70～1.80）。通過設計引物、PCR擴增、瓊脂糖電泳檢測和PCR條帶切膠回收等步驟，對擴增的PCR產物進行檢測及純化。PCR擴增反應體系：擴增液22 μL，反應液1.0 μL，樣本DNA 2.0 μL。最后采用熒光原位雜交技術進行圖像掃描，用TL 998A染色體核型分析系統分析圖像，判斷基因型。

1.7 統計學分析

應用SPSS 19.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差表示。基因頻率采用基因計數法計算，各組間基因頻率采用χ2檢驗。采用t檢驗和單因素方差分析比較不同組間血藥濃度的差異，P<0.05為差異具有統計學意義。采用Logistic回歸分析評估基因多態性與不良反應的相關性，用風險度（odds ratio，OR）及95%可信區間（confidence interval，CI）表示。

2 結果

2.1 一般資料

本研究共納入65例ALL患兒，男性31例，女性34例，患兒平均年齡（7.44±3.56）歲，平均BMI（24.36±5.77）kg·m-2，平均給藥劑量（3.12±0.87）g·m-2。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗及基因型分布

檢測結果顯示MTHFR C677T和A1298C的基因頻率和等位基因頻率均無顯著性差異（P>0.05），符合Hardy-Weinberg平衡定律，患者具有群體代表性，見表1。

表1 MTHFR C677T和A1298C基因型及等位基因頻率.例（%）Tab 1 Genotypes and allele frequencies of MTHFR C677T and A1298C.case(%)

2.3 MTHFR基因型分布

MTHFR A1298C AA型在女性患兒中的分布頻率顯著高于男性（χ2=4.71，P=0.03）。C677T CC型和A1298C AC型在0～3歲患兒中的分布頻率顯著高于其他年齡組（χ2=13.87，P=0.001； χ2=15.01，P=0.00），C677T TT和A1298C CC型在3～6歲和6～14歲患兒的分布頻率顯著高于0～3歲年齡組（χ2=30.93，P=0.00；χ2=30.61，P=0.00），見表2。

表2 MTHFR基因型在患兒中的分布.例（%）Tab 2 Distribution of MTHFR genotypes in pediatric patients.case(%)

2.4 基因多態性與血藥濃度

MTX血藥濃度在24 h時達到峰值，在48～72 h逐漸降低。MTHFR C677T的TT型患兒在HD-MTX化療后24、48、72 h的血藥濃度結果均顯著高于CC型和CT型患兒（P<0.01）；MTHFR A1298C的CC型患兒在HD-MTX化療后24、48、72 h的血藥濃度結果均顯著高于AA型和AC型患兒（P<0.01），見表3。

表3 MTHFR基因型與HD-MTX化療后血藥濃度的關系Tab 3 Relationship between MTHFR genotypes and serum concentration after HD-MTX chemotherapy

2.5 基因多態性與不良反應

MTHFR C677T的TT型發生血小板減少的風險較CC型顯著增高（P=0.001）；TT型和CT型發生Ⅰ級以上骨髓抑制的風險較CC型顯著增高（P<0.01）；TT型發生Ⅱ級以上白細胞減少的風險較CC型顯著增高（P=0.000）。

MTHFR A1298C的CC型和AC型發生血小板減少的風險較AA型顯著增高（P<0.01）；CC型和AC型發生Ⅰ級以上骨髓抑制的風險較AA型顯著增高（P<0.01）；CC型發生Ⅱ級以上白細胞減少的風險較AA型顯著增高（P=0.000）。詳見表4。

表4 MTHFR基因型與藥品不良反應發生情況.例次（%）Tab 4 MTHFR genotypes and adverse drug reactions.case(%)

3 討論

ALL是一種原始細胞在骨髓異常增生和聚集并浸潤到各組織和器官從而引起一系列臨床表現的惡性血液疾病[4]。MTX是治療兒童ALL的一線化療藥物，HD-MTX能透過人體的血腦、血睪和血眼屏障[9]，從而預防髓外白血病，提高化療效果。MTX治療窗窄、毒性高、個體差異大，在清除腫瘤細胞的同時，對正常組織細胞也有殺傷作用[10]，因此MTX在臨床治療中常伴隨許多嚴重不良反應，如黏膜炎、肝腎功能損傷、骨髓抑制等[11]。

MTHFR是葉酸代謝途徑的限速酶，其基因突變可導致MTHFR活性減低而影響葉酸代謝，加重MTX不良反應[12]。目前對于MTX基因多態性對血藥濃度及不良反應的影響沒有定論，且個別研究結果存在爭議。王軼睿等[13]對MTX化療常見不良反應的影響因素進行分析并發現不同MTHFR基因型患者在HDMTX給藥后24、48、72 h的血藥濃度差異均無統計學意義（P>0.05）。張夏蘭等[14]研究結果發現MTHFR C677T的雜合突變CT型可能導致酶活性顯著下降，MTX清除率降低，腎損傷發生率增加。Chae等[6]對117例ALL維持治療的患兒進行研究發現MTHFR C677T TT基因型患者的黏膜炎發生率顯著高于CC、CT型患者。其他研究[15-16]也報道了MTHFR C677T和A1298C基因突變可增加ALL患兒MTX化療相關不良反應發生的風險。

本研究結果顯示MTHFR C677T突變純合TT型發生血小板減少、Ⅰ級以上骨髓抑制和Ⅱ級以上白細胞減少的風險較CC型高（P<0.01），突變雜合CT型發生Ⅰ級以上骨髓抑制的風險較CC型高（P<0.01）。MTHFR A1298C的突變純合CC型和突變雜合AC型發生血小板減少和Ⅰ級以上骨髓抑制的風險較AA型高（P<0.01）。這與Chae和王軼睿等[6,13]研究結果不一致，但與Tantawy和Vang等[15-16]研究結果一致。其研究結果存在差異的原因可能與不同種族患者的遺傳多態性存在個體差異性有關。

此外，本研究還發現MTHFR C677T和A1298C基因多態性與ALL患兒MTX化療后24、48、72 h的血藥濃度存在相關性。MTHFR C677T的TT型和A1298C的CC型患兒的血藥濃度顯著高于CC型和AA型。這與以往研究[17-19]結果一致。

綜上，MTHFR C677T和A1298C基因多態性可能影響我院ALL患兒HD-MTX化療后的血藥濃度和不良反應發生情況。其原因可能與患兒基因突變而降低MTHFR酶活性，減少5-甲基四氫葉酸的生成，使體內MTX代謝緩慢，致血藥濃度升高有關。提示ALL患兒在化療前可通過檢測MTHFR基因多態性來預測HD-MTX可能的藥品不良反應，并及時調整MTX給藥劑量，做好解救措施。