HPLC法測定人血清中替加環素濃度的建立和臨床應用

李文超，吳燕川，沈 芊，蘇 甦，李曉玲，白向榮（.首都醫科大學宣武醫院藥學部/國家老年病醫學研究中心，北京0005；2.首都醫科大學藥學院，北京 0005；.首都醫科大學宣武醫院中心實驗室，北京 0005）

替加環素（tigecycline，TGC）是甘氨酰四環素類抗生素，具有強大的體外抗菌活性，在臨床中多用于治療多重耐藥菌引起的感染[1]。作為一種脂溶性抗生素，替加環素給藥后快速分布于體內，血藥濃度個體差異性較大[2]。此外，替加環素體內抗菌活性與感染部位、病原體種類以及患者的病理生理狀態等密切相關。而多重耐藥菌感染的患者病理生理情況通常十分復雜，病情較為嚴重，因此進行替加環素的治療藥物監測十分必要。故本研究建立了一種高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定替加環素的血藥濃度，并將其應用于經該藥治療的多重耐藥革蘭陰性菌感染的重癥患者血清樣本分析，以期為后續進行替加環素藥動學/藥效學研究及開展治療藥物監測奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相-可變波長檢測系統（HPLC-VWD，安捷倫科技有限公司），包括：G1322A脫氣機、G1311A四元泵、G1329A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1314B可變波長檢測器；反相Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；Thermo HERAEUS FRESCO21臺式微量高速冷凍離心機[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；WH-86I旋渦混合器（江蘇太倉鹿河生化儀器廠）；Eppendorf移液器（德國Eppendorf公司）；AUY220分析天平（日本島津公司）。

1.2 試藥

替加環素對照品（北京百奧萊博科技有限公司，批號：TG021447，純度：98.0%）；鹽酸米諾環素對照品（上海Sigma Aldrich公司，批號：0000095799）；1-辛烷磺酸鈉對照品（Sigma Aldrich公司，批號：MKCF5895，純度：98.0%）；高氯酸（上海金鹿化工有限公司，批號：130455，純度：72%）；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純，水為滅菌注射用水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.023 mmol?L-1磷酸鹽緩沖液（24∶76，v/v，pH=3.0）；流速1.0 mL?min-1；柱溫25 ℃；檢測波長246 nm；進樣量50 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 標準溶液和質控溶液 取替加環素標準品5 mg，精密稱定，置于5 mL量瓶中，加入蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1.00 mg?mL-1的替加環素儲備液，置于–40 ℃冰箱保存。臨用前將該儲備液用pH=3.0，0.1 mmol?L-1的磷酸鹽緩沖液逐級稀釋成質量濃度分別為25.000、10.000、5.000、2.500、1.250、0.500 μg?mL-1的系列標準溶液以及15.000、5.000、0.125 μg?mL-1的混合質控溶液。

2.2.2 內標溶液 取鹽酸米諾環素對照品5 mg，精密稱定，置于5 mL量瓶中，加入蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1.00 mg?mL-1內標儲備液，置于–40 ℃冰箱保存。臨用前將該儲備液用pH=3.0，0.1 mmol?L-1的磷酸鹽緩沖液稀釋成質量濃度為100 μg?mL-1的內標溶液。

2.3 血清樣品的處理

取空白血清160 μL，加入相應質量濃度的替加環素標準溶液40 μL，內標溶液10 μL，渦旋混勻30 s，加入0.4 mol?L-1高氯酸200 μL，渦旋混勻1 min，以12 000 r·min-1離心15 min，取上清液50 μL，進樣分析；取一例使用替加環素治療患者的待測血清200 μL，加入內標溶液10 μL，渦旋混勻30 s，加入0.4 mol?L-1高氯酸200 μL，渦旋混勻1 min，以12 000 r·min-1離心15 min，取上清液50 μL進樣分析。

2.4 專屬性考察

取替加環素標準溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。取6份不同來源空白血清160 μL，加入到1.5 mL離心管中，不加入內標溶液，按照“2.3”項下方法處理樣品，進樣分析，結果顯示空白血清中干擾組分的響應低于替加環素定量下限的20%，且低于內標響應的5%，內源性物質不干擾替加環素及內標的測定；另取6份不同來源空白血清160 μL，加入1.5 mL離心管中，加入“2.3”項下40 μL最低定量下限溶液（0.5 μg?mL-1），處理樣品，進樣分析。樣品分析時間為15 min，人血清中替加環素和內標的保留時間分別為6.85 min和9.20 min。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A–替加環素+鹽酸米諾環素標準溶液，B–人空白血清，C–人空白血清+替加環素+鹽酸米諾環素；1–替加環素，2–鹽酸米諾環素Fig 1 HPLC chromatogramA–tigecycline and minocycline hydrochloride standardized solution,B–human blank serum,C–human blank serum + tigecycline+minocycline hydrochloride; 1–tigecycline,2–minocycline hydrochloride

2.5 標準曲線與定量下限

取空白血清、相應質量濃度的替加環素標準溶液適量，分別配制成質量濃度為5.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.100 μg?mL-1的含藥血清樣品，按照“2.3”項下方法處理后，進樣分析，記錄色譜圖。以待測物與內標質量濃度的比值（X）為橫坐標，以待測物與內標峰面積的比值（Y）為縱坐標，用加權最小二乘法擬合曲線，得到替加環素的標準曲線為Y=0.463 6 X–0.061 2，r=0.998 6，替加環素在0.100～5.000 μg?mL-1范圍內線性關系良好，定量下限為0.100 μg?mL-1（S/N≥10）。

2.6 精密度與準確度

分別配制替加環素定量下限質量濃度（0.100 μg?mL-1）的血漿樣品和低、中、高質量濃度（0.250、1.000、3.000 μg?mL-1）的質控樣品，按“2.3”項下方法處理后，連續測定3 d，每個濃度各取5份樣本分析 ,根據當日標準曲線計算質控樣品的實測質量濃度，考察方法的準確度RE和精密度RSD，結果顯示日內精密度RSD分別為2.48%、2.13%、2.33%；日內準確度RE分別為8.08%、6.41%、3.46%。日間精密度RSD分別為9.18%、3.59%、4.30%；日間準確度RE分別為2.17%、3.94%、0.80%。見表1。

表1 人血清中替加環素日內、日間精密度和準確度試驗結果Tab 1 Intra-day and inter-day precision and accuracy test results of tigecycline in human serum

2.7 稀釋效應

替加環素血藥濃度的個體差異較大，有時需對高質量濃度樣品進行稀釋以考察方法的稀釋效應。本試驗考察了高質量濃度樣品稀釋5倍的稀釋效應。將質量濃度為20.000 μg?mL-1的含藥血清用空白基質稀釋至4.000 μg?mL-1后，平行測定5個樣本。結果顯示，其RE和RSD分別為–2.09%和5.41%，準確度和精密度均在±15%范圍內。

2.8 提取回收率

取質量濃度為15.000、5.000、0.125 μg?mL-1的質控溶液各40 μL，分別置于離心管中，加入空白血清160 μL，制成質量濃度分別為3.000、1.000、0.250 μg?mL-1的質控樣品，每個濃度平行做3份，按照“2.3”項下方法處理后，再按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積A1。取空白血清200 μL，加入0.4 mol?L-1高氯酸200 μL，渦旋混勻1 min，以12 000 r·min-1離心20 min，采用沉淀后的基質配制高、中、低質量濃度的質控樣品，再按照色譜條件進樣測定，記錄峰面積A2。以A1/A2計算相對回收率。結果顯示替加環素的提取回收率在99.43%～116.68%，內標回收率為116.66%，提取回收率RSD<15%，方法一致性較好。

2.9 穩定性試驗

將“2.2”項下的低、高濃度質控溶液加入到160 μL混合空白血清中，分別制備成低、高濃度質控樣品（0.250、3.000 μg?mL-1）若干份，分別考察不同條件下替加環素的穩定性，每種試驗條件下低、高濃度質控樣本各3個，按照“2.3”項下方法處理血清樣品，血清樣品3次凍融考察反復凍融穩定性。血清樣品于–40 ℃放置30 d考察低溫保存穩定性。血清樣品在室溫下放置4、6 h后進行分析，考察室溫放置穩定性。處理后樣本在4 ℃放置24 h，考察在自動進樣器中的穩定性。結果表明，替加環素血清樣本經過反復凍融3次、–40 ℃保存40 d、室溫放置4 h，處理后樣品在自動進樣器4 ℃放置24 h，測定值的RSD和RE均在15%范圍內，表明替加環素樣品在上述條件下穩定。詳見表2。

表2 替加環素樣品穩定性試驗結果Tab 2 Stability test results of tigecycline samples

2.10 干擾性試驗

查閱本院患者聯合用藥，篩選13種最常與替加環素聯用的藥物，將頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、萬古霉素、伏立康唑、氟康唑、美羅培南、阿米卡星、亞胺培南西司他丁鈉、利奈唑胺、甲潑尼龍琥珀酸鈉、地塞米松磷酸鈉、維生素C、維生素K1、間羥胺的標準品分別在該色譜條件下進樣，在替加環素及內標保留時間處未出現重疊吸收峰。

2.11 方法學應用

采用本方法測定11例多重耐藥革蘭陰性菌感染的重癥患者血清中替加環素的質量濃度。本研究方案經我院醫學倫理委員會審核通過（批準號：PX20200805），患者簽署知情同意書。11例患者給藥途徑均為靜脈滴注，維持劑量為100 mg或50 mg，給藥間隔為q 12 h，于藥物濃度達穩態后（療程≥5 d）9、12 h靜脈采血，按“2.3”項下方法處理血清樣品，進樣分析，結果顯示患者用藥后血藥濃度范圍為0.117～0.831 μg?mL-1，所建立方法能夠滿足臨床患者血清中替加環素濃度檢測要求。詳見表3。

表3 11例患者使用替加環素達穩態后血藥濃度監測值Tab 3 Plasma concentration at steady state in 11 patients using tigecycline

3 討論

3.1 色譜條件優化

本研究考察了甲醇-磷酸鹽緩沖液、乙腈-磷酸鹽緩沖液兩種體系，在乙腈-磷酸鹽體系中待測物出峰響應值較高，故采用后者。研究過程中還對比了磷酸鹽緩沖液在pH為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0條件下待測物的保留行為，結果顯示在pH=3.0條件下，替加環素與米諾環素出峰時間受生物基質影響小、響應值較高。在色譜柱選擇上，本研究探究了待測物在ZORBAX Extend C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）和反相Kromasil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱上的保留行為，結果顯示在ZORBAX Extend C18柱上待測物出峰響應值較低且后拖尾嚴重，試用Kromasil C18柱， 替加環素與米諾環素分離效果較好。

3.2 內標品種與蛋白沉淀試劑

現有研究采用米諾環素[3]、雷尼替丁[4]、四環素[5]等作為內標，本研究首先采用雷尼替丁作為內標化合物，在乙腈-磷酸鹽緩沖液流動相條件下未發現相應色譜峰，遂選擇米諾環素，其出峰與替加環素色譜峰分離度較好且響應值較高。本研究樣品處理方法較為簡單，采用蛋白沉淀法，對比研究高氯酸、乙腈和甲醇作為蛋白沉淀劑，結果發現三者均可較好沉淀蛋白，由于替加環素在體內分布廣泛、血藥濃度較低，最終選擇1∶1比例的0.4 mol?L-1高氯酸進行蛋白沉淀處理。

3.3 與現有分析方法的比較

目前多采用LC-MS/MS法檢測替加環素血藥濃度[6-9]，在滿足測定濃度范圍的情況下，相較于LCMS/MS法，HPLC法[4]儀器成本與檢測費用更低，更利于該藥血藥濃度監測的推廣與一些基礎藥動學研究。本測定方法采用高氯酸沉淀蛋白后直接進樣、磷酸鹽與乙腈流動相等度洗脫，單次測定時間為15 min，總體而言，測定方法較為簡單、便捷，利于大規模開展替加環素的血藥濃度監測。

3.4 替加環素治療藥物監測與PK/PD研究開展的必要性

替加環素是有較長抗生素后效應的時間依賴性抗菌藥物，對于醫院獲得性肺炎，其藥動學/藥效學參數閾值為AUC0-24h/MIC>4.5[10]。目前幾項臨床研究[10-12]表明，標準劑量（50 mg，q 12 h，ivgtt）的替加環素給藥方案相較于維持劑量加倍（100 mg）的給藥方案，更易引起醫院獲得性肺炎的治療效果不佳，因此開展治療藥物監測與PK/PD研究實屬必要。通過PK/PD研究找出該藥PK/PD參數閾值與臨床療效、細菌清除的關系并實際應用于臨床，對提高替加環素治療的有效性與安全性具有積極作用。