丹梔逍遙散對D-氨基半乳糖/脂多糖誘導的大鼠急性肝損傷保護作用機制研究*

劉尚智，張志強，李昇錦

急性肝損傷(ALI)病情進展快且病情極為兇險，診治不及時將嚴重影響肝臟的解毒、合成和轉化等功能，甚至進展為肝功能衰竭，危及患者的生命健康[1，2]。藥物濫用是引發肝病的重要原因之一，然而目前臨床上尚缺乏明確的肝功能保護和促進肝細胞再生的特效方案。近期有文獻研究證實丹梔逍遙散在肝功能保護方面具有一定的效果。丹梔逍遙散又被稱為八味逍遙散或加味逍遙散，藥理學研究證實其具有疏肝健脾和清熱活血的功效，尤其適用于肝郁血虛生熱癥患者，目前在臨床各科疾病治療上被廣泛應用[3，4]。脂多糖(LPS)屬于內毒素中的一種，其可誘導氧化應激反應和全身炎癥反應，易致急性肝損傷，而D-氨基半乳糖(D-GaIN)屬于特異性肝損傷藥物，研究證實其可耗竭肝細胞內三磷酸尿嘧啶核苷，同時抑制RNA的合成及其蛋白質表達。此外，D-GaIN可促進腸道對內毒素的吸收，增強LPS的肝臟毒性[5，6]。本研究采用D-GaIN/LPS誘導急性肝損傷大鼠模型，觀察了丹梔逍遙散的保護作用及其可能的作用機制，有望為ALI的有效治療提供更多的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物與試劑 由上海斯萊克生物有限公司提供的健康雄性SD大鼠110只，體質量為180～200 g(合格證號：2012001606577)。購于安徽老百姓大藥房的丹梔逍遙散由牡丹皮、梔子、當歸和芍藥等中藥組成，將藥片煎成湯汁、濃縮備用，生藥濃度為2 g/mL，實驗前用蒸餾水配成所需濃度，用于給大鼠灌胃。上海生工生物有限公司提供的D-GaIN(批號：A600474)，美國Sigma公司生產的LPS(批號：L4130)，美國R&D公司提供的ELISA試劑盒(批號：VAL609)，中生北控生物科技股份有限公司生產的檢測血生化指標試劑(批號：20120819)，南京建成生物工程研究所提供的檢測丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-PX，批號：20121222)試劑盒，上海生工生物有限公司提供的檢測白介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α，批號：20120915)試劑盒和透明質酸酶(HA)、層黏連蛋白(LN)和Ⅲ型前膠原(Ⅲ-PC，批號：20110723)。其余試劑均屬于國產分析純試劑。

1.2 ALI模型的制備 隨機將110只大鼠分為對照組、模型組、小劑量、中劑量和大劑量中藥干預組，每組22只。給予大鼠D-GaIN 700 mg.kg-1和LPS 1 mg.kg-1腹腔注射，建立ALI模型，給予對照組大鼠等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)腹腔注射。在建模成功后15 min，分別給予丹梔逍遙散3.83 g.kg-1、7.66 g.kg-1和15.33 g.kg-1(灌藥體積為10 mL/kg)灌胃，而在模型組和對照組，則給予等體積生理鹽水灌胃。所有大鼠持續灌胃7 d，1次/d。

1.3 觀察指標 在實驗結束時，處死大鼠，取肝組織，固定于甲醛溶液中，行病理學檢查。經腹主動脈取血，采用ELISA法檢測血清MDA、SOD和GSH-PX和IL-6、IL-β和TNF-α水平；采用放射免疫分析法檢測血清肝纖維化指標。

2 結果

2.1 各組肝組織病理學表現 模型組肝組織細胞排列不規律，存在大量的血管破裂和紅細胞彌散，細胞形態異常；經小劑量、中劑量和大劑量丹梔逍遙散干預后，隨著藥物劑量的增加，肝組織病變程度逐漸減輕(圖1)。

2.2 各組大鼠肝功能指標比較 模型組血清總膽紅素和轉氨酶水平顯著高于對照組(P<0.05)，而各劑量藥物干預組血清AST、ALT、TBIL水平顯著低于模型組(P<0.05，表1)。

2.3 各組血清氧化應激反應指標比較 模型組血清MDA水平顯著高于，而血清SOD和GSH-PX水平顯著低于對照組(P<0.05)；各劑量藥物干預組血清MDA水平顯著低于，而血清SOD和GSH-PX水平顯著高于模型組(P<0.05，表2)。

2.4 各組血清細胞因子水平比較 模型組血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著高于對照組(P<0.05)，而各劑量藥物干預組血清細胞因子水平顯著低于模型組(P<0.05，表3)。

2.5 各組血清肝纖維化指標比較 模型組血清HA、LN、Ⅲ-PC顯著高于對照組(P<0.05)，而各劑量藥物干預組血清HA、LN、Ⅲ-PC水平顯著低于模型組(P<0.05，表4)。

圖1 各組肝組織病理學表現(HE，200×)A：對照組；B：模型組；C：小劑量干預組；D中劑量干預組；E：大劑量干預組

表1 各組大鼠肝功能指標比較

表2 各組血清氧化應激反應指標比較

表3 各組血清細胞因子水平比較

表4 各組血清肝纖維化指標比較

3 討論

本研究結果顯示，ALI模型制備成功，經中藥干預后，動物血清AST、ALT、TBIL水平降低，提示丹梔逍遙散可有效減輕肝臟損害，對大鼠肝功能有一定的保護作用，與相關研究報道基本相符[7-10]。

本實驗結果還顯示模型組血清MDA、IL-6、IL-β、TNF-α、HA、LN、Ⅲ-PC均呈顯著升高，經小劑量、中劑量和大劑量中藥干預后，血清細胞因子和氧化應激指標降低。早期相關研究表明D-GaIN/LPS對肝臟損傷主要通過肝細胞內尿苷二磷酸途徑，繼而影響肝細胞能量代謝和蛋白質合成，在增加細胞內鈣離子濃度的同時，導致谷胱苷苷肽耗竭和TNF-α釋放，繼而引起細胞凋亡[11，12]。IL-6、IL-1β、TNF-α為常見的炎癥介質，通過促進炎癥細胞聚集活化和炎癥介質的釋放，引起內皮細胞功能失調和炎癥癥狀加重。IL-1β主要通過激活內皮細胞繼而誘導細胞間黏附分子表達，與TNF-α相互促進，而IL-6參與多種生物學效應，是介導炎癥反應發生的重要因素[13，14]。當機體處于氧化應激狀態時，MDA、SOD、GSH-PX將異常表達，SOD可抑制自由基啟動的脂質過氧化反應，在機體抗氧化方面發揮重要作用，其水平高低間接預示機體清除自由基的能力[15]。MDA為脂質過氧化反應的產物之一，可嚴重破壞細胞膜結構并導致細胞腫脹壞死，而GSH-PX則可有效保護細胞膜結構和功能的完整性[16]。本研究結果初步提示ALI大鼠存在明顯的氧化應激反應和炎癥反應，推測肝功能損傷和纖維化狀態或與機體氧化應激反應和炎癥反應密切相關。本研究結果同樣證實，隨著丹梔逍遙散用藥劑量的加大，對氧化應激反應、炎癥反應和肝纖維化的改善作用更明顯。丹梔逍遙散主要由柴胡、牡丹皮、炒山梔、芍藥、茯苓、當歸、炒白術和炙甘草組成，方中柴胡有疏肝解郁作用，牡丹皮可清火，炒山梔則由清肝熱的功效，而當歸養血和血，白芍養血斂陰、柔肝緩急，茯苓、白術、甘草則益氣健脾，全方諸藥聯用共奏疏肝清熱和養血健脾之功[17，18]。現代藥理學研究證實柴胡對大鼠肝功能存在明顯的保護作用，同時可有效改善大鼠肝纖維化程度。牡丹皮和梔子等均被證實存在明顯的肝功能保護作用[19，20]。