紫蘇醛對(duì)心肌缺血/再灌注損傷大鼠心肌保護(hù)作用機(jī)制及其最佳劑量研究

張小賞，童隨陽(yáng)，操傳斌

急性心肌梗死是冠心病的嚴(yán)重類型，急性ST段抬高型心肌梗死是致死、致殘的主要原因［1］。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）可快速、有效地開通罪犯血管、挽救心肌［2］，但缺血的心肌組織得到灌注后損傷反而加重，出現(xiàn)如心律失常、原有梗死面積擴(kuò)大、心室功能低下加重等現(xiàn)象［3］。其發(fā)生機(jī)制包括活性氧產(chǎn)生增加、血管通透性增加引起炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等［4］，而藥物處理或調(diào)動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制是對(duì)抗心肌缺血/再灌注（ischemic/reperfusion，I/R）損傷的重要策略，且近年來(lái)中醫(yī)藥在心肌I/R損傷的治療中應(yīng)用越來(lái)越廣泛［5］。紫蘇醛（perilla aldehyde，PAH）是從中藥紫蘇中提取的精油的主要成分，是一種天然單環(huán)萜類化合物，日常中被用作食品添加劑。多項(xiàng)研究表明，PAH具有抗氧化、抗菌、抗焦慮等特性［6-7］。已有研究表明，PAH可以抑制炎癥反應(yīng)和中性粒細(xì)胞募集，減輕煙曲霉菌角膜炎；此外，PAH還可直接殺滅煙曲霉菌［8］。但其對(duì)心肌I/R損傷的作用尚不明確。本研究旨在分析PAH是否對(duì)I/R損傷大鼠有心肌保護(hù)作用及其機(jī)制，并分析其最佳劑量，以期為臨床干預(yù)心肌I/R損傷提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2020年6月至2021年6月。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)成年雄性Sprague-Dawley大鼠32只，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。飼養(yǎng)于明/暗12 h交替的環(huán)境中，環(huán)境溫度維持25 ℃，相對(duì)濕度為（60±5）%，給予充足的水和食物。

1.2.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 PAH、羧甲基纖維素購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、干擾素（interferon，IFN）-γ和白介素（interleukin，IL）-6測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，多導(dǎo)生理記錄儀購(gòu)自美國(guó)BIOPAC公司，BX53熒光顯微鏡購(gòu)自?shī)W林巴斯（中國(guó)）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 檢測(cè)大鼠血清cTnI、CK、LDH水平及評(píng)估大鼠心肌損傷評(píng)分 選取20只大鼠，將其隨機(jī)分為假手術(shù)組、I/R損傷組、PAH18+I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組、PAH72+I/R損傷組，每組4只。假手術(shù)組、I/R損傷組給予0.5%羧甲基纖維素連續(xù)灌胃1周，PAH18+I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組、PAH72+I/R損傷組分別給予18、36、72 mg/kg的PAH連續(xù)灌胃1周。之后I/R損傷組、PAH18+I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組、PAH72+I/R損傷組參考文獻(xiàn)［9］建立心肌I/R損傷模型：對(duì)大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg），于仰臥位將其固定于手術(shù)臺(tái)上，使用Biopac多導(dǎo)生理記錄儀連接心電圖機(jī)，連續(xù)監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，氣管插管后連接呼吸機(jī)，在胸骨左側(cè)3～4肋間切開皮膚，分離各肌層后剪開心包膜，暴露心臟，在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐旁溝交界下緣2～3 mm處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。心電圖Ⅱ?qū)?lián)R波增寬，ST段抬高及心臟局部變蒼白表明結(jié)扎成功，30 min后再灌注2 h，抬高的ST段逐漸下降，心臟局部蒼白變?yōu)榧t色，出現(xiàn)炎性水腫、滲出，證明心肌I/R損傷模型構(gòu)建成功。假手術(shù)組做相同的手術(shù)，但只穿線不結(jié)扎。再灌注期結(jié)束后，對(duì)各組大鼠實(shí)施安樂死，并采集血液和心肌組織用于檢測(cè)大鼠血清cTnI、CK、LDH水平及評(píng)估大鼠心肌損傷評(píng)分。

1.3.1.1 檢測(cè)大鼠血清cTnI、CK、LDH水平 采血后以3 000 r/min離心15 min（離心半徑8.6 cm），取上清液，檢測(cè)血清cTnI、CK、LDH水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3.1.2 評(píng)估大鼠心肌損傷評(píng)分 將心肌組織采用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，在BX53熒光顯微鏡下，從每組的兩個(gè)切片中隨機(jī)選擇6個(gè)視野（×200），由兩人采用盲法進(jìn)行評(píng)分：0分為無(wú)損傷；1分為輕度壞死（伴有間質(zhì)水腫和灶性壞死），2分為中度壞死（伴有彌漫性心肌細(xì)胞腫脹、灶性壞死），3分為重度壞死（壞死伴收縮帶和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)），4分為極重度壞死。

1.3.2 檢測(cè)大鼠血漿TNF-α、IFN-γ、IL-6水平將剩余的12只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組，每組4只，干預(yù)方法同上，采集各組大鼠血液標(biāo)本，4 000 r/min離心15 min（離心半徑8.6 cm），取上層血漿，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)TNF-α、IFN-γ、IL-6水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 假手術(shù)組、I/R損傷組、PAH18+I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組、PAH72+I/R損傷組大鼠血清cTnI、CK、LDH水平比較 假手術(shù)組、I/R損傷組、PAH18+I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組、PAH72+I/R損傷組大鼠血清cTnI、CK、LDH水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。I/R損傷組、PAH18+I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組、PAH72+I/R損傷組大鼠血清cTnI、CK、LDH水平高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PAH36+I/R損傷組、PAH72+I/R損傷組大鼠血清cTnI水平低于I/R損傷組，PAH18+I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組、PAH72+I/R損傷組大鼠血清CK、LDH水平低于I/R損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PAH36+I/R損傷組、PAH72+I/R損傷組大鼠血清cTnI、CK水平低于PAH18+I/R損傷組，PAH72+I/R損傷組大鼠血清LDH水平低于PAH18+I/R損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PAH72+I/R損傷組大鼠血清CK、LDH水平低于PAH36+I/R損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 假手術(shù)組、I/R損傷組、PAH18+I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組、PAH72+I/R損傷組大鼠血清cTnI、CK、LDH水平比較（±s，n=4）Table 1 Comparison of serum cTnI，CK and LDH levels inSham group，I/R injury group，PAH18+I/R injury group，PAH36+I/R injury group and PAH72+I/R injury group

表1 假手術(shù)組、I/R損傷組、PAH18+I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組、PAH72+I/R損傷組大鼠血清cTnI、CK、LDH水平比較（±s，n=4）Table 1 Comparison of serum cTnI，CK and LDH levels inSham group，I/R injury group，PAH18+I/R injury group，PAH36+I/R injury group and PAH72+I/R injury group

注：cTnI=心肌肌鈣蛋白I，CK=肌酸激酶，LDH=乳酸脫氫酶，I/R=缺血/再灌注，PAH=紫蘇醛；a表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b表示與I/R損傷組比較，P＜0.05；c表示與PAH18+I/R損傷組比較，P＜0.05；d表示與PAH36+I/R損傷組比較，P＜0.05

組別 cTnI（pg/ml） CK（U/L） LDH（U/L）假手術(shù)組 102.4±2.1 2 087.0±95.4 1 699.6±46.3 I/R損傷組 271.1±7.4a 4 696.7±183.6a 2 544.4±29.8a PAH18+I/R損傷組 269.3±4.1a 4 317.9±185.9ab 2 401.2±107.3ab PAH36+I/R損傷組 258.4±4.2abc 4 005.7±76.3abc 2 284.3±61.5ab PAH72+I/R損傷組 254.5±9.5abc 3 558.2±172.6abcd 2 100.8±127.9abcd F值 567.39 449 691.50 61.43 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 假手術(shù)組、I/R損傷組、PAH18+I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組、PAH72+I/R損傷組大鼠心肌損傷評(píng)分比較 假手術(shù)組大鼠心肌損傷評(píng)分為0分，I/R損傷組、PAH18+I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組、PAH72+I/R損傷組大鼠心肌損傷評(píng)分分別為（3.3±0.5）、（3.0±0.0）、（1.8±0.5）、（1.5±0.6）分。I/R損傷組、PAH18+I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組、PAH72+I/R損傷組大鼠心肌損傷評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.80，P＜0.001）。PAH36+I/R損傷組、PAH72+I/R損傷組大鼠心肌損傷評(píng)分低于I/R損傷組、PAH18+I/R損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 假手術(shù)組、I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組大鼠心肌組織TNF-α、IFN-γ、IL-6水平比較 假手術(shù)組、I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組大鼠心肌組織TNF-α、IFN-γ、IL-6水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組大鼠心肌組織TNF-α、IFN-γ、IL-6水平高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PAH36+I/R損傷組大鼠心肌組織TNF-α、IFN-γ、IL-6水平低于I/R損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 假手術(shù)組、I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組大鼠血漿TNF-α、IFN-γ、IL-6水平比較（x± s，n=4，pg/ml）Table 2 Comparison of TNF-α，IFN-γ，IL-6 levels in plasma of rats in Sham group，I/R injury group，PAH36+I/R injury group

3 討論

再灌注治療可以快速、有效地開通罪犯血管，從而挽救心肌，但再灌注后心肌損傷是臨床缺血性心臟病患者血流灌注恢復(fù)后常見的病理生理現(xiàn)象［10］。再灌注心肌細(xì)胞會(huì)引發(fā)過(guò)度的炎癥反應(yīng)，通過(guò)細(xì)胞因子如IL-1β、IL-10和TNF-α的快速釋放，引發(fā)進(jìn)一步的心肌損傷［11］。研究表明，抑制炎癥反應(yīng)可以減輕I/R損傷大鼠心肌損傷或缺氧/復(fù)氧所致的心肌細(xì)胞損傷［12］，如核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體通路的激活參與了心肌I/R損傷，而葛根素［13］、青蒿素［14］等可以在一定程度上減輕心肌I/R損傷。PAH是從中藥紫蘇中提取的一種用途廣泛的單萜類化合物，具有抗炎和抗真菌作用［15］。已有研究表明，PAH可抑制脂多糖誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6的表達(dá)，減輕腸道炎癥［16］。結(jié)合PAH可作為食品添加劑，表明其用于人體相對(duì)安全，本研究嘗試探索PAH與心肌I/R損傷的聯(lián)系。

心肌梗死導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜破壞后，細(xì)胞內(nèi)的大量酶被釋放到血液中，臨床上常可檢測(cè)到cTnI、CK、LDH水平升高［17］。本研究結(jié)果顯示，I/R損傷組、PAH18+I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組、PAH72+I/R損傷組大鼠血清cTnI、CK、LDH水平高于假手術(shù)組；假手術(shù)組大鼠心肌損傷評(píng)分為0；PAH36+I/R損傷組、PAH72+I/R損傷組大鼠心肌損傷評(píng)分低于I/R損傷組、PAH18+I/R損傷組；提示PAH在18、36、72 mg/kg劑量下均可減輕心肌缺血，減少心肌損傷。由于臨床在評(píng)估急性心肌梗死的指標(biāo)中，cTnI的特異性較高［1］，而PAH18+I/R損傷組cTnI水平與I/R損傷組相近，可認(rèn)為18 mg/kg的PAH對(duì)心肌I/R損傷的保護(hù)作用較36、72 mg/kg的PAH相對(duì)較弱；PAH72+I/R損傷組大鼠血清CK、LDH水平低于PAH36+I/R損傷組，但PAH72+I/R損傷組大鼠血清cTnI水平、心肌損傷評(píng)分與PAH36+I/R損傷組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可暫認(rèn)為36、72 mg/kg的PAH對(duì)心肌I/R損傷的保護(hù)作用差別不大，但考慮到增加藥物劑量可能會(huì)增加藥物毒性，故本研究選擇36 mg/kg為PAH的最佳作用劑量。

心肌I/R損傷可降低心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，引起炎癥反應(yīng)，損傷心功能，增加心肌梗死面積，從而增加患者死亡率［17-19］。TNF是一種重要的細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫、凋亡與炎癥等多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路［20-21］，在心肌I/R損傷過(guò)程及其他疾病的病理過(guò)程中均發(fā)揮重要作用［10，22-23］。研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可以降低TNF-α水平，從而阻斷NF-κB途徑，減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到改善心肌I/R損傷的目的［13，24］。IL-6是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，研究發(fā)現(xiàn)，抗IL-6治療可減少炎癥、貧血，并具有抗血管生成作用，阻斷IL-6對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病有明顯療效［25］。有研究者用煙曲霉菌菌絲刺激PAH預(yù)處理后的人角膜上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PAH可明顯下調(diào)煙曲霉菌誘導(dǎo)的炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表達(dá)，使角膜混濁明顯減少，潰瘍面積明顯縮小，進(jìn)而減輕煙曲霉菌角膜炎；其進(jìn)一步構(gòu)建煙曲霉菌感染的小鼠模型，并探討PAH減輕煙曲霉菌角膜炎的機(jī)制，結(jié)果顯示，PAH處理組小鼠角膜中中性粒細(xì)胞水平低于對(duì)照組［8］。本研究結(jié)果顯示，I/R損傷組、PAH36+I/R損傷組大鼠血漿TNF-α、IFN-γ、IL-6水平高于假手術(shù)組，PAH36+I/R損傷組大鼠血漿TNF-α、IFN-γ、IL-6水平低于I/R損傷組，表明PAH可以降低心肌I/R損傷大鼠炎癥因子水平，減輕炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、組織水腫，提示PAH通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)來(lái)發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

綜上所述，PAH可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)來(lái)減輕心肌I/R損傷大鼠的心肌損傷程度，進(jìn)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用，且其最佳劑量為36 mg/kg。但由于本研究樣本量較小，且沒有監(jiān)測(cè)血藥濃度、肝腎功能生化指標(biāo)，未能全面衡量PAH的不良反應(yīng)，在臨床應(yīng)用PAH前有待進(jìn)行更多的大樣本量實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)本研究結(jié)論。

作者貢獻(xiàn)：張小賞、操傳斌進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、可行性分析；張小賞、童隨陽(yáng)進(jìn)行文獻(xiàn)、資料的收集、整理；張小賞撰寫、修訂論文；操傳斌負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。