SHP2抑制劑PHPS1通過調(diào)節(jié)MAPK通路對(duì)ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響

帖彥清 霍麗靜 馬倩 趙培 于悅卿 路永剛 于芳

動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管發(fā)病的病理基礎(chǔ)。其中，脂質(zhì)代謝異常和炎性損傷是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的主要誘因[1,2]。因此，改善動(dòng)脈粥樣硬化患者體內(nèi)的脂質(zhì)代謝和阻止炎性因素進(jìn)一步損傷是改善動(dòng)脈粥樣硬化形成的主要方法。目前，針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療主要為應(yīng)用降脂藥物，但因其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，故降脂并不能從根本上治愈動(dòng)脈粥樣硬化引起的心腦血管疾病。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)所必需的一類重要的信號(hào)通路，可調(diào)控多種心腦血管疾病的發(fā)病過程，其主要包括C-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)[3]。相關(guān)研究表明，MAPK參與內(nèi)皮細(xì)胞的激活、泡沫細(xì)胞的形成、內(nèi)皮祖細(xì)胞的凋亡和多種促動(dòng)脈粥樣硬化細(xì)胞因子的表達(dá)[4]。PHPS1(phenyl hydrazonopyrazolone sulfonate1)是一種具有細(xì)胞滲透性的SHP2抑制劑，能夠有效抑制SHP2磷酸化并阻斷其參與的細(xì)胞活動(dòng)和疾病進(jìn)程[5]。已有的相關(guān)研究表明，PHPS1可通過抑制p-SHP2和p-ERK蛋白的表達(dá)，進(jìn)而減少病變肺部中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，最終改善實(shí)驗(yàn)小鼠的肺炎癥狀[6]。那么，PHPS1在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮什么作用，它是否可調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化炎性因子的釋放，筆者發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究較少。因此，本研究以ApoE-/-小鼠為研究對(duì)象，探討PHPS1對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的作用及作用機(jī)制，以期為臨床提供一種新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理方法 將8周齡雄性C57BL/6J-ApoE-/-小鼠(動(dòng)物合格證號(hào)：201721850)隨機(jī)選取10只作為對(duì)照組，不做其他特殊處理，其余小鼠對(duì)其進(jìn)行6周的高脂飼料喂養(yǎng)建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，建模成功后將其隨機(jī)分為模型組(腹腔注射0.9%氯化鈉溶液3 mg·kg-1·d-1，n=10)和PHPS1組(腹腔注射PHPS1劑量3 mg·kg-1·d-1，n=10)，同時(shí)對(duì)照組也給予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液3 mg·kg-1·d-1，1次/d，持續(xù)20 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來源及分組 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購自美國ATCC公司。將RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素DMEM培養(yǎng)基，37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%時(shí),根據(jù)培養(yǎng)基中加入的成分不同將RAW264.7分為3組,即對(duì)照組(未予特殊處理的DEME培養(yǎng)基)、模型組(給予ol-LDL處理的DEME培養(yǎng)基)及PHPS1組(同時(shí)給予ol-LDL和PHPS1處理的DEME培養(yǎng)基)。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 p-PI3K、p-AKT、p-mTOR均購自abcam公司；DMEM/高糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國GIBCO公司；組織包埋機(jī)(型號(hào)：EG11508)、石蠟切片機(jī)型號(hào)(型號(hào)：RM2135)均購自Leica公司；熒光倒置顯微鏡(型號(hào)：Axio Vert A1)購自德國Carl Zeiss Jena；Western Blot用電泳槽(型號(hào)：DYCZ-24DN型)、轉(zhuǎn)移電泳儀(型號(hào)：DYY-7B型)及恒溫循環(huán)器(型號(hào)：WD-9412A型)均購自北京六一生物科技有限公司；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)：8845-S型)購自美國Bio-rad公司；電子天平(型號(hào)：MP200A型)購自上海精科儀器廠；制冰機(jī)(型號(hào)：SIM-F124型)購自日本5ANY0有限公司；全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)貝克曼5800，美國貝克曼公司)；酶標(biāo)儀(型號(hào) ELX800，北京Bio-Tek公司)等相關(guān)試劑及儀器。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 全自動(dòng)生化儀檢測(cè)小鼠體內(nèi)TG、TC、HDL-C及LDL-C的表達(dá)水平：小鼠腹主動(dòng)脈取血后放入離心機(jī)內(nèi)3 500 r/min 離心 25 min，獲得血清后采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)3組小鼠血清中TG、TC、HDL-C及LDL-C的表達(dá)水平。

1.4.2 Movat染色評(píng)估主動(dòng)脈根部斑塊面積：取小鼠主動(dòng)脈根部血管制成石蠟切片，常規(guī)脫臘至水后行Movat染色，顯微鏡下評(píng)估動(dòng)脈斑塊大小，數(shù)據(jù)通過Image Pro Plus-6軟件(Media Cybernetics，Inc.)進(jìn)行分析。

1.4.3 Western blot檢測(cè)3組p-SHP2、p-JNK、p-p38 MAPK及p-ERK蛋白的表達(dá)水平：將上述所取主動(dòng)脈根部組織研磨提取蛋白后，進(jìn)行WB檢測(cè)，聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 電泳分離蛋白后再轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃冰箱中一抗孵育過夜，PBST充分洗滌后加入相應(yīng)二抗(ab97080)室溫孵育1 h，ECL顯色,化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中顯影，IPP 6.0軟件行灰度掃描分析,以GAPDH為內(nèi)參校正目的蛋白表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法 Western blot檢測(cè)3組RAW264.7細(xì)胞p-SHP2、p-JNK、p-p38 MAPK及p-ERK蛋白水平：將上述各組細(xì)胞研磨提取蛋白后，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 電泳分離蛋白后再轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃冰箱中一抗孵育過夜，PBST充分洗滌后加入相應(yīng)二抗(ab97080)室溫孵育1 h，ECL顯色,化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中顯影，IPP 6.0 軟件行灰度掃描分析,以GAPDH為內(nèi)參校正目的蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 全自動(dòng)生化儀檢測(cè)小鼠體內(nèi)TG、TC、HDL-C及LDL-C的表達(dá)水平：全自動(dòng)生化儀結(jié)果顯示，模型組小鼠中TG、TC及LDL-C表達(dá)最高，HDL-C 表達(dá)最低，其次依次為PHPS1組、對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 血脂水平比較

2.1.2 Movat染色評(píng)估主動(dòng)脈根部斑塊面積:Movat染色結(jié)果顯示，PHPS1組主動(dòng)脈根部顯示斑塊面積較對(duì)照組和模型組明顯減小，模型組斑塊較對(duì)照組明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)照組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊較少，可忽略。對(duì)照組內(nèi)膜未見增厚，基本沒有泡沫細(xì)胞及斑塊，模型組的內(nèi)膜明顯增厚且伴有大量的泡沫細(xì)胞聚集及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，中膜細(xì)胞的排列紊亂，PHPS1組的內(nèi)膜增厚程度較模型組明顯減輕并且泡沫細(xì)胞聚集及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。見表2，圖1。

表2 主動(dòng)脈根部斑塊面積比較

圖1 主動(dòng)脈根部的斑塊面積(Movat染色×40)

2.1.3 Western blot檢測(cè)3組p-SHP2、p-JNK、p-p38 MAPK及p-ERK蛋白的表達(dá)水平：Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組p-SHP2、p-JNK、p-p38 MAPK及p-ERK的蛋白表達(dá)水平最高，其次依次為PHPS1組、對(duì)照組的p-SHP2、p-JNK、p-p38 MAPK及p-ERK的蛋白表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 組織中p-SHP2、p-JNK、p-p38 MAPK及p-ERK蛋白的表達(dá)水平

圖2 Western blot檢測(cè)組織中p-SHP2、p-JNK、p-p38 MAPK及p-ERK蛋白的表達(dá)水平

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Western blot檢測(cè)3組細(xì)胞p-SHP2、p-JNK、p-p38 MAPK及p-ERK蛋白水平：Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組p-SHP2、p-JNK、p-p38 MAPK及p-ERK蛋白的表達(dá)水平最高，其次依次為PHPS1組、對(duì)照組，3組間4種指標(biāo)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中p-SHP2、p-JNK、p-p38 MAPK及p-ERK蛋白水平

表4 細(xì)胞中p-SHP2、p-JNK、p-p38 MAPK及p-ERK蛋白的表達(dá)水平

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是老年人最常見的死亡原因之一。動(dòng)脈粥樣硬化的主要病變的特征是脂質(zhì)在動(dòng)脈部分沉積，并伴有平滑肌細(xì)胞和纖維基質(zhì)增生，并逐漸發(fā)展成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[7]。動(dòng)脈粥樣硬化通常被認(rèn)為是一種慢性炎癥性疾病，其相關(guān)炎癥是由促炎細(xì)胞因子、炎癥信號(hào)通路、生物活性脂質(zhì)和粘附分子共同介導(dǎo)的[8]。由于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制尚未完全清楚，故并不能從根本上治愈動(dòng)脈粥樣硬化引起的心腦血管疾病。因此，本研究以MAPK促炎信號(hào)通路為線索，通過應(yīng)用SHP2抑制劑PHPS1觀察對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響。

SHP2(Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase)是蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTP)家族成員之一，由PTPN11基因編碼在人類細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)，主要有2個(gè)酪氨酸磷酸化結(jié)合位點(diǎn)SH2結(jié)構(gòu)域和1個(gè)具有催化功能的PTP結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[9]。SHP2參與多種細(xì)胞信號(hào)的調(diào)節(jié)作用。相關(guān)研究表明，SHP2可通過相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)和細(xì)菌清除中的作用。PHPS1是一種針對(duì)SHP2特異性抑制劑，可有效抑制SHP2磷酸化并阻斷其參與的細(xì)胞活動(dòng)和疾病進(jìn)程[10,11]。

本研究發(fā)現(xiàn)給予PHPS1治療后ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積明顯減小且小鼠體內(nèi)炎性因子的表達(dá)水平同樣明顯降低。既往研究顯示，PHPS1能夠抑制炎性反應(yīng)、減輕或延緩AS的發(fā)生[6]。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路是細(xì)胞中一條重要的分子通路，MAPK由多種同工酶組成，包括ERK，JNK和p38 MAPK[12]。JNK 通路和 p38 MAPK 通路主要對(duì)炎性細(xì)胞因子和多種類型的細(xì)胞應(yīng)激信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，而ERK通路主要對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和分化信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，他們之間可以通過不同因素刺激激活，形成不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活不同的轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)不同的生物學(xué)效應(yīng)，通路間可產(chǎn)生相互協(xié)同或抑制作用[13-16]。

活化的p38能促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)分泌炎性因子，而JNK能被TNF-α和IL-1β等炎性因子激活；ERK1/2有促進(jìn)炎性細(xì)胞因子表達(dá)的作用，并與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和分化密切相關(guān)[17-19]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組WB檢查提示p-SHP2、p-JNK、p-p38 MAPK及p-ERK蛋白的表達(dá)明顯升高且斑塊面積明顯增大，說明MAPK信號(hào)通路可促進(jìn)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的形成。

給予PHPS1藥物治療后，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)WB結(jié)果均提示p-SHP2、p-JNK、p-p38 MAPK及p-ERK蛋白的表達(dá)明顯降低且斑塊面積明顯減小，說明PHPS1可通過抑制MAPK信號(hào)通路從而抑制炎性因子的釋放，最終抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。給予PHPS1藥物治療后，小鼠體內(nèi)TG、TC及LDL-C明顯下降，HDL-C表達(dá)明顯上升。既往研究同樣表明，其余干預(yù)因素作用于MAPK信號(hào)通路后即可引起小鼠體內(nèi)TG、TC及LDL-C表達(dá)的下降，HDL-C表達(dá)的上升[4,20,21]。說明MAPK信號(hào)通路可調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)脂質(zhì)的代謝狀態(tài)。

綜上所述，SHP2抑制劑PHPS1通過下調(diào)MAPK信號(hào)通路從而抑制ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。