自身免疫性腦炎患者外周血濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞升高的臨床研究

張運(yùn)偉，喻 明，李琳林

(遂寧市中心醫(yī)院神經(jīng)三病區(qū)，四川 遂寧 629000)

自身免疫性腦炎(AE)是一種由異常的致病性自身抗體的產(chǎn)生從而介導(dǎo)引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病，被認(rèn)為是腦炎最常見的原因之一[1]。目前發(fā)現(xiàn)的AE抗N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)是AE最常見的一種類型，通常與畸胎瘤相關(guān)；所有AE患者往往病情較重，且臨床表現(xiàn)多種多樣，嚴(yán)重時(shí)甚至危及患者的生命安全，由于自身抗體介導(dǎo)的病情復(fù)雜，疾病發(fā)展的預(yù)估性差[2]。由于機(jī)體免疫系統(tǒng)功能受到抑制，大腦中神經(jīng)細(xì)胞被損傷，AE患者出現(xiàn)記憶認(rèn)知功能、運(yùn)動(dòng)障礙、癲癇等精神癥狀[3]。當(dāng)腦部器官受到破壞及毒素的侵襲時(shí)腦部組織及神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)為腦實(shí)質(zhì)減少、炎癥狀態(tài)，繼而導(dǎo)致全身臟器被感染破壞[4]。但因該病發(fā)病隱匿，且臨床癥狀比較廣泛，可用于診斷的檢查較少，不利于AE患者的早期診斷[5]。濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞(Tfh)可能存在于淋巴組織B淋巴細(xì)胞區(qū)生發(fā)中心中的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，高表達(dá)趨化因子受體5(CXCR5)[6]。很多研究表明，在所有自身免疫性疾病(包括AE)的發(fā)生、發(fā)展中作為輔助B淋巴細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞亞群Tfh 的過度活化與增殖可能是該類疾病發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]。為探討患者外周血Tfh百分比對(duì)AE患者的臨床意義，本研究回顧性分析了本院收治的35例AE抗體陽性患者的臨床資料，其中5例為抗富亮氨酸膠質(zhì)瘤失活蛋白1(LGI1)抗體陽性患者，6例為抗γ-氨基丁酸受體(GABAR)抗體陽性患者，7例為抗α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸受體(AMPAR)抗體陽性患者，17例為抗NMDAR抗體陽性患者，探討了Tfh檢測(cè)對(duì)AE患者的臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取2018年1月至2020年12月本院收治的AE抗體陽性患者35例，其中男15例，女20例；年齡23～76歲，平均(52.23±8.33)歲；已婚22例，未婚13例。根據(jù)患者是否使用激素和免疫抑制劑治療分為未治療組(12例)和治療組(23例)。另外選擇同期健康體檢者20例作為對(duì)照組。按照改良RANKIN量表(MRS)評(píng)分將治療組患者分為治療后緩解組(治療后 MRS 評(píng)分下降至40分，15例)和治療后未緩解組(治療后 MRS 評(píng)分大于50分，8例)。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn)[7](1)符合AE診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)簽署本研究知情同意書。

1.1.3排除標(biāo)準(zhǔn)[8](1)神經(jīng)類疾病；(2)依從性差，不配合治療；(3)患有肝臟、心臟、腎臟等嚴(yán)重疾病；(4)對(duì)照組排除各種自身免疫性疾病等。

1.2方法

1.2.1Tfh檢測(cè)

1.2.1.1分離外周血單個(gè)核細(xì)胞 采集各組研究對(duì)象靜脈血4 mL于乙二胺四乙酸抗凝管中，再取同外周血體積相等的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋，混合均勻后取4 mL淋巴細(xì)胞分離液，將混合均勻的外周血與緩沖液混合液緩慢加到淋巴分離液上，3 000 r/min離心30 min后將分離后中間的單個(gè)核細(xì)胞層吸取備用。其次使提取的單個(gè)核細(xì)胞被四色熒光標(biāo)記，通過流式洗液使單個(gè)核細(xì)胞被洗滌2次，加入檢測(cè)T淋巴細(xì)胞CD3+抗體、檢測(cè)白細(xì)胞分化抗原CD4抗體、抗程序性死亡受體1抗體、高表達(dá)趨化因子受體5抗原提呈細(xì)胞后在室溫下孵育30 min后通過流式洗液，并再洗滌單個(gè)核細(xì)胞2次，洗滌后進(jìn)行重懸。然后進(jìn)行流式細(xì)胞分析，被四色熒光標(biāo)記后的單個(gè)核細(xì)胞在流式細(xì)胞儀的作用下使不同顏色之間的重疊區(qū)被單色補(bǔ)償管調(diào)節(jié)，對(duì)熒光強(qiáng)度值結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.1.2免疫熒光染色 (1)制備大鼠腦片，用4%多聚甲醛對(duì)大鼠進(jìn)行灌注，灌注后剝?nèi)〈笫竽X組織，高滲蔗糖脫水后再冰凍腦組織，對(duì)被冷凍的腦組織進(jìn)行切片處理。(2)免疫熒光染色，取AE抗體陽性患者腦脊液與大鼠腦片在44 ℃下共同孵育，孵育12 h后用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌，加入二抗(Ab-cam 試劑盒)后避光孵育2 h后復(fù)染。

1.2.2觀察指標(biāo) 觀察各組研究對(duì)象外周血單個(gè)核細(xì)胞Tfh百分比，以及 Tfh百分比與患者病情的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1各組研究對(duì)象Tfh百分比比較 未治療組患者外周血 Tfh百分比[(26.08±3.05)%]明顯高于對(duì)照組[(5.83±1.93)%]，治療組患者外周血 Tfh百分比[(14.68±2.85)%]明顯低于未治療組。3組研究對(duì)象Tfh百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.073，P<0.05)。

2.2Tfh百分比與患者病情的相關(guān)性 治療后未緩解組患者外周血Tfh百分比[(28.98±3.24)%]明顯高于對(duì)照組，治療后緩解組患者外周血 Tfh百分比[(6.98±2.68)%]明顯低于治療后未緩解組。3組研究對(duì)象Tfh百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.799，P<0.05)；治療后緩解組患者Tfh百分比與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.176，P>0.05)。治療后外周Tfh百分比與AE患者病情評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

2.3免疫熒光染色結(jié)果 將AE抗體陽性患者腦脊液與大鼠腦切片共同孵育染色結(jié)果為陽性。各型抗體陽性結(jié)果見圖1。

圖1 各型抗體陽性結(jié)果

3 討 論

Tfh屬于位于淋巴濾泡生發(fā)中心區(qū)的一種CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，需要CXCR5受體和B淋巴細(xì)胞趨化因子13配體，高表達(dá)B淋巴細(xì)胞淋巴瘤因子6[9]。Tfh可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞活化，可參與自身免疫性疾病的任何階段[10]。體液中的免疫細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞相互作用并發(fā)生免疫應(yīng)答，從而充分發(fā)揮免疫細(xì)胞的作用。

近年來，自身免疫性疾病發(fā)病率逐年升高，自身免疫性疾病患者體內(nèi)均存在Tfh異常升高。自身反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞參與了淋巴濾泡生發(fā)中心反應(yīng)，最終導(dǎo)致致病性自身抗體的形成，由此導(dǎo)致疾病的發(fā)生[11]。目前發(fā)現(xiàn)，Tfh參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病的發(fā)生[12-13]。

由于AE患者病因復(fù)雜，臨床癥狀也較廣泛，并無特異性指征[14]。目前，主要通過檢測(cè)外周血和腦脊液抗體，以及腦電圖、核磁共振檢查等手段進(jìn)行診斷。早期診斷并給予有效的治療可在一定程度上提高患者生存率。對(duì)AE患者進(jìn)行快速、有效的診斷成為巨大的挑戰(zhàn)。一直以來，人們也在積極探索AE的生物標(biāo)志物，以便實(shí)現(xiàn)快速、高效的診斷。已有研究發(fā)現(xiàn)，腦脊液顆粒蛋白前體是早期抗NMDAR腦炎的潛在生物標(biāo)志物[15]。此外，近年來，越來越多的自身免疫相關(guān)性腦炎抗體被發(fā)現(xiàn)，如細(xì)胞表面抗體(NMDAR、GABAAR、GABABR、AMPAR、富亮氨酸膠質(zhì)瘤失活蛋白1、調(diào)節(jié)亞單位二肽基肽酶樣蛋白、接觸蛋白相關(guān)蛋白-2、抗神經(jīng)元表面抗體介導(dǎo)的tau蛋白、代謝型谷氨酸受體5型、甘氨酸受體、多巴胺D2受體、突觸蛋白-3α抗體)、細(xì)胞內(nèi)抗體(抗神經(jīng)元抗體I型、谷氨酸脫羧酶、坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白抗體)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞抗體(水通道蛋白4、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體)等。為尋找AE的生物標(biāo)志物開辟了新的路徑，但還是未能進(jìn)行高靈敏度的預(yù)測(cè)。隨著抗體種類的增多，其檢測(cè)費(fèi)用明顯增加，此外，抗體陰性AE患者具有AE的臨床表現(xiàn)，免疫治療具有一定療效，但自身免疫抗體呈陰性。究其原因，疾病早期抗原暴露有限，抗體滴度較低，難以檢出。故需尋找一種簡單、有效的檢測(cè)方式。

為探索AE的可能發(fā)病機(jī)制，本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了Tfh在AE抗體陽性患者外周血的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，未治療組患者Tfh百分比明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明AE患者Tfh出現(xiàn)了異常增殖。而對(duì)經(jīng)過免疫治療的患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，臨床癥狀未緩解的患者Tfh百分比明顯高于對(duì)照組，經(jīng)過規(guī)范化治療后的患者外周血Tfh百分比明顯低于未治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，治療后外周Tfh百分比與AE患者病情評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，表明檢測(cè)外周Tfh百分比可在一定程度上預(yù)測(cè)AE患者的病情，對(duì)改善患者預(yù)后具有極為重要的作用。

目前，關(guān)于AE的具體病理機(jī)制尚不完全清楚。流行病學(xué)資料表明，AE發(fā)病率極低，約為13.7/100 000[16]。因此，對(duì)尋求這種患病率極低卻能很好地指示疾病的發(fā)生、發(fā)展的一種生物標(biāo)志物很有必要。本研究結(jié)果顯示，AE患者外周血Tfh百分比可輔助臨床診斷，并對(duì)病情進(jìn)行有效的預(yù)測(cè)，具有較高的臨床意義。此外，該項(xiàng)檢測(cè)方法操作性強(qiáng)，所受的限制條件較少，具有較高的安全性，并且操作簡單，檢查過程中所需時(shí)間較短，經(jīng)濟(jì)成本也較低，適宜廣泛開展。