植物DNA 甲基化及在牧草中的應用

馮成龍，劉暢，李波，沈童飛，金姍姍，趙金諾，劉家佑，張君輝，姜思琦，石婉瑩

（齊齊哈爾大學 1.生命科學與農林學院，2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

在各種不利條件下，植物可以通過多種基因調控機制恢復和重建細胞內穩態.科學家對與環境脅迫相關的基因進行了大量研究，包括基因表達模式、轉錄后修飾模式以及由基因編碼的蛋白質的功能和作用模式[1].相關研究豐富了植物適應干旱、鹽堿、低溫和高溫等非生物脅迫的抗性理解，從而擴大耕地面積，提高作物產量.近年來，科學家發現表觀遺傳修飾廣泛參與植物的脅迫反應.

表觀遺傳修飾主要包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑和非編碼RNA[1]，將影響染色質的結構和可塑性，并動態調節基因表達.DNA 甲基化是研究最廣泛的表觀遺傳修飾類型，它是通過改變染色質結構、DNA 構象、DNA 穩定性以及DNA 與蛋白質之間的相互作用調控基因表達[2].對于植物體而言，環境發生變化會導致與之相對應的表觀遺傳變異，在植物非生物脅迫反應中起著至關重要的作用，使植物能夠在惡劣的環境中生存.本文主要綜述了近年來DNA 甲基化的基本概況，以及牧草應對非生物脅迫下的DNA甲基化調控，旨在為利用表觀遺傳機制提高牧草的抗脅迫能力研究提供指導.

1 DNA 甲基化概述

1.1 DNA 甲基化概念和修飾方式

DNA 甲基化是指DNA 復制后，在DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化下，將S-腺苷酰甲硫氨酸（S-adenosyl-methionine，SAM）分子上的甲基（-CH）轉移到DNA 分子中胞嘧啶殘基的5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（m5C）的過程[3].DNA 甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾形式，在植物、細菌和哺乳動物中廣泛存在，修飾方式多種多樣，被修飾的位點堿基有腺嘌呤N-6 位、胞嘧啶N-4 位、鳥嘌呤N-7 位或胞嘧啶C-5 位等，其甲基供體由SAM 提供，在DNMT 的催化作用下，以共價鍵結合的方式獲得一個甲基基團的化學修飾過程[4].其產物5-甲基胞嘧啶（m5C）是植物DNA 甲基化的主要形式，在維持基因組穩定、抑制內源性逆轉錄病毒、X 染色體失活、基因組印記和發育基因調控等多種生物學過程中，DNA 甲基化起著至關重要的作用，現已成為分子生物學的主要研究方向之一.

1.2 植物DNA 甲基化的主要特點

（1）修飾方式.植物DNA 甲基化修飾方式主要為5-甲基胞嘧啶（m5C），少量為N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）和7-甲基鳥嘌呤（N7-mG），其中m5C 修飾方式占DNA 中胞嘧啶堿基的1/3；（2）發生區域.植物DNA 甲基化主要發生在CpG 區序列中，還可在CHG 和CHH（H=A，C 或T）序列中發生，但發生頻率較低；（3）甲基化程度.著絲粒和中心體周圍區域、核糖體RNA 編碼序列、轉座子序列等異染色質區域的DNA 甲基化程度較高，多數啟動子區域的甲基化程度較低，通常甲基化不會發生在非重復基因位點[4]；（4）甲基化水平.植物基因組DNA 甲基化比例較動物高[5].

2 牧草DNA 甲基化檢測方法和建立

2.1 牧草DNA 甲基化的檢測方法

近年來，甲基化分析方法發展迅速，可以分為基因組DNA 的甲基化檢測法和特定DNA 片段的甲基化檢測法兩大類.在牧草DNA 甲基化檢測技術中，主要分為高效液相色譜技術（high performance liquid chromatography，HPLC）、甲基化敏感擴增多態性技術（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）、亞硫酸氫鹽測序法（bisulfite sequencing，BS）等技術手段.需要根據具體研究目標、參考基因組序列的可用性和樣本數量等選擇相應的檢測技術，目前對牧草基因組DNA 的甲基化檢測法多采用MSAP技術（見表1）.

表1 牧草DNA 甲基化檢測方法與基因表達功能分析

2.2 牧草DNA 甲基化的建立

牧草DNA 甲基化主要是發生在胞嘧啶5′C 位置的甲基化，在基因組序列的CG，CHG 和CHH 序列中的胞嘧啶上均可發生，3 種DNA 甲基轉移酶（見表2）的綜合作用影響DNA 甲基化的水平和DNA 甲基化是否發生，分別為維持型甲基轉移酶Ⅰ（maintenance methyltranferaseⅠ，METⅠ）、結構域重排甲基轉移酶（Domains rearranged methyltransferase，DRM）、染色質甲基化酶（Chromomethylase，CMT）[20].

表2 DNA 甲基轉移酶的作用

植物中有2 種甲基化模式：一為從頭甲基化，指以前未甲基化的DNA 雙鏈的胞嘧啶的甲基化過程，靠維持型甲基化酶來保持其穩定狀態；二為DNA 甲基化的維持，指細胞分裂的復制過程中，通過維持甲基化酶的作用，在DNA 半保留復制出的新生鏈相應位置上進行甲基化修飾[21].

3 DNA 甲基化在植物中的應用

植物中的DNA 甲基化在植物生長發育過程中具有十分重要的調控作用，可發生在植物生長的不同階段和組織中，不同程度的DNA 甲基化調節基因表達，導致植物發育和形態變異.

3.1 DNA 甲基化在植物中的作用

3.1.1 調節植物生長發育 在植物的正常生長發育過程中，基因組中的DNA 甲基化和去甲基化共同作用確保植物的正常生長發育.不同時期和不同組織中都可發生DNA 甲基化水平的差異.隨著植物生長發育時間的延長，組織和器官中會出現組織特異性，與其相關的特異性基因正常表達，而與組織特異性無關的基因則被滅活.

3.1.2 調控植物開花 植物進行低溫處理與開花密不可分，通過低溫降低其基因組中DNA 甲基化水平，使開花基因表達，原因是低溫春化誘導開花相關基因去甲基化，當去甲基化發生時，可調節一些開花相關基因的表達.

3.1.3 植物衰老相關 DNA 甲基化水平與植物衰老密切相關.相關研究表明，植物基因組DNA 的甲基化狀態與衰老有關，尚不清楚這一因素是起主要作用還是控制植物衰老的原因之一，對植物不同生育期所對應的DNA 甲基化水平的研究有可能揭示植物衰老、成熟與基因組DNA 甲基化程度之間的關系.

3.1.4 植物抵抗逆境 植物遭遇低溫、干旱、鹽堿和重金屬等逆境脅迫時，基因組DNA 甲基化可以維持植物基因組功能的穩定性，防止逆境對植物功能基因表達的影響.

3.2 DNA 甲基化與牧草對不同逆境關系分析

DNA 甲基化對植物形態構建和逆境環境的適應起著關鍵作用，環境溫度回升或降低伴隨著DNA 甲基化水平的改變.隨著牧草生長環境的改變，基因組DNA 甲基化水平發生不同變化，在表觀遺傳上表現出多態性.DNA 甲基化可控制基因表達，有利于提高植物對逆境環境的適應能力.

3.2.1 鹽脅迫下牧草DNA 甲基化水平變化 在鹽脅迫下，導致苜?；蚪MDNA 甲基化水平產生不同的變化.Al-Lawati[13]等對鹽脅迫改變苜蓿DNA 甲基化水平進行研究，用蒸餾水和NaCl 質量濃度為0.0，5.6，8.4，14.0 g/L 灌溉植物1 周，采用MSAP 的方法測定紫花苜蓿根系中的胞嘧啶甲基化水平，結果顯示NaCl濃度增加了整體DNA 甲基化水平，特別是在高鹽度水平（14.0 g/L）的苜蓿中，由于甲基轉移酶同源基因受鹽分誘導過量表達所致.與此相反，Mahmoud W[12]等對模式植物蒺藜苜蓿響應鹽脅迫的全基因組DNA 甲基化分析，將播種后9 周的蒺藜苜蓿植株用204 mmol 的NaCl 溶液灌溉植株1 周，對鹽脅迫處理下苜蓿根組織的DNA 樣本進行差異全基因組亞硫酸氫鹽測序，約有5 000 萬個差異甲基化位點被識別，其中7%的位點隨著鹽度的變化而顯著改變，且基因組DNA 甲基化水平在鹽脅迫下呈降低趨勢.

3.2.2 低溫脅迫下牧草DNA 甲基化水平變化 在低溫脅迫下，導致苜蓿基因組DNA 甲基化水平產生不同的變化.陳云[14]對12 份黃花苜蓿遺傳多樣性及6 份黃花苜蓿低溫條件下甲基化水平進行分析，采用MSAP檢查分析技術，選擇多態性豐富和重復性比較好的10 對引物進行擴增，測試甲基化總帶數分別為130.75，154 條，全甲基化百分率平均為62.9%，76.5%，說明12 個苜蓿品種間甲基化模式存在一定差異，基因組甲基化水平高，反映了表觀遺傳修飾的物種差異，低溫脅迫提高了苜蓿基因組甲基化水平，其DNA 甲基化參與了苜蓿低溫脅迫的調控.孟德斌[17]等以8 個抗寒能力不同的紫花苜蓿品種為材料，對3 個時期（降溫前、降溫時和寒流后）的紫花苜蓿葉片采用HPLC 技術檢測DNA 甲基化水平，隨著溫度的降低，紫花苜?；蚪MDNA 甲基化水平升高；隨著溫度升高，甲基化水平先降低后升高，DNA 甲基化水平變化在13.02%～39.63%之間，不同品種基因組間DNA 甲基化水平存在差異，3 個時期紫花苜蓿甲基化水平在品種間未表現出差異，而是在時期因素下差異顯著，反映了紫花苜蓿可以通過調節自身DNA 甲基化水平的升高來適應溫度的提升.

3.2.3 干旱脅迫下牧草DNA 甲基化水平變化 在干旱脅迫下，導致黑麥草和老芒麥基因組DNA 甲基化水平產生不同變化.湯小梅[8]等采用MSAP 技術研究了干旱脅迫下多年生黑麥草DNA 甲基化的變化，在全基因組范圍內，MSAP 共檢測到652 個CCGG 位點，對照組和干旱處理組的總甲基化水平分別為57.67%，47.39%，干旱脅迫降低了黑麥草總DNA 甲基化水平，甲基化程度與表達呈負相關.DNA 甲基化在適應干旱環境中發揮重要作用，誘導的基因組表觀遺傳變化在黑麥草適應干旱環境中發揮重要的調控作用.陳云[14]對20 份老芒麥遺傳多樣性及2 份老芒麥干旱條件下甲基化水平進行分析，采用MSAP 檢查分析技術，選擇多態性豐富和重復性比較好的15 對引物進行擴增，測試甲基化總帶數為376 條，占全甲基化百分率為79%，干旱脅迫4，6，8 d 的老芒麥總甲基化多態性分別為8.0%，14.4%，23.0%，說明老芒麥基因組DNA甲基化多態性水平隨干旱脅迫時間的增加而增加.

4 結語

DNA 甲基化是植物表觀遺傳的重要方式，在調控植物的生長發育、開花、衰老、抗性等過程中均發揮著重要的調節作用.逆境脅迫誘導的甲基化變化可參與牧草對環境的適應性調節，對于揭示牧草對逆境適應機制、豐富牧草逆境育種理論具有重要指導意義.