蛹蟲草廢棄米基發酵工藝初探

李欣南 ， 葉 齊， 田曉玲， 馬新宇， 趙曉云， 韓鐫竹

（1.遼寧省檢驗檢測認證中心遼寧省農產品及獸藥飼料產品檢驗檢測院，遼寧沈陽 110016；2.沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院，遼寧沈陽 110016；3.沈陽市第四十三中學，遼寧沈陽 110036）

隨著蛹蟲草培育技術的成熟與發展，其產量也隨之不斷增大，據調查，平均每個生產廠家蛹蟲草的產量可達2000 kg/月，而栽培蛹蟲草剩余的廢棄米基多達6000 kg 以上 （肖千明，2017）。然而， 這些廢棄米基都作為廢棄的原料被扔掉，不僅造成環境的污染，也造成了能源的浪費。 蛹蟲草廢棄米基是在蛹蟲草采摘后所剩的蛹蟲草的基礎培養基（文庭池等，2017；韋強等，2009），富含大量的氨基酸、多糖、蟲草素等營養物質，可利用價值很高 （王建芳等，2005； 韋會平等，2004）， 因此對其開發利用有可觀的經濟效益和社會效益（汪晶晶等，2016）。

當前，人民生活水平日益提高，人類對肉類、蛋類等食物需求不斷提高， 促使相關產業迅速發展， 同時造成飼養畜類禽類的飼料不同程度上的短缺（劉艷新等，2017；喬楓等，2013）。 因此，將生產蛹蟲草剩余的廢棄米基作為一種基礎培養基用于發酵生產，開發新型飼料，不僅可以減少對環境的污染也可避免資源的浪費（阮萍等，2017）。 因此，本試驗以蛹蟲草廢棄米基為發酵培養基，利用酵母菌作為發酵菌株，以蛋白質、蟲草素等營養指標為參考，確定發酵工藝，為開發出以廢棄米基為原料的新型飼料產品提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 釀酒酵母、 嗜酸乳桿菌均由遼寧省檢驗檢測認證中心提供。

1.1.2 培養基 蛹蟲草廢棄米基由沈陽蟲林密寶北蟲草食品科技有限公司提供； 酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（YPD）、乳酸細菌培養基（MRS）購自青島高科園海博生物科技有限公司。

1.1.3 試劑及儀器設備 尿素、氯化鈉等試劑購自國藥集團； 蟲草素標準品購自上海安譜科技公司； 甲醇 （色譜純） 購自默克股份有限公司；ESJ182-4 電子天平 （沈陽龍騰電子有限公司）；FW 80 高速粉碎機 （天津市泰斯特儀器有限公司）；三洋高壓滅菌鍋（MLS-3750-3780）；電熱鼓風干燥箱YLA-6000 （上海實驗儀器有限公司）；恒溫培養箱（Memmert 260 INplus）；近紅外光譜儀（Foss NIRS DS 2500）；高效液相色譜儀Agilent 1100（美國安捷倫科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 發酵基礎培養基的制備 10%半固體廢棄米基（以下稱為10%固體米基），廢棄米基與水的混合比例為1:10（m/m），經121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻備用， 其余比例半固體培養基均按照料水質量比配制，滅菌方法同上。

1.2.2 平板計數 采用平板涂布法， 將樣品用0.85%的生理鹽水按1:10 依次稀釋至適宜濃度，選取3 個稀釋濃度， 分別吸取菌懸液0.1 mL 于事先準備好的培養基上（酵母菌使用YPD，嗜酸乳桿菌使用MRS， 混合菌使用兩種平板分別計數）， 用一次性無菌涂布棒將菌懸液在培養基表面涂布均勻，放置培養箱內（酵母菌28 ℃，嗜酸乳桿菌30 ℃，混合菌29 ℃），培養72 h 計數（龔軍輝等，2018）。

1.2.3 衛生指標的測定 霉菌總數按國標GB/T 13092 飼料中霉菌總數測定方法； 大腸菌群按國標GB/T 18869 飼料中大腸菌群的測定方法。

1.2.4 營養指標 按國標GB/T 18868 飼料中水分、粗蛋白質、粗纖維、粗脂肪、賴氨酸、蛋氨酸快速測定方法近紅外光譜法； 沙門氏菌按照國標GB/T 13091 飼料中沙門氏菌的檢測方法 （湯旭等，2013）。

1.2.5 蟲草素的測定 采用高效液相色譜法進行測定，以甲醇：水=85:15 等度洗脫，流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃。 取蟲草素標準品， 分別配制1、5、10、20、50、100 μg/mL 濃度的標準品溶液，測定標準品的峰面積，并以標準品的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

空白米基及樣品的含量測定：稱取6 份發酵樣品以及1 份空白米基，每份0.5 g，分別置于100 mL錐形瓶中， 加入80 mL 水，85 ℃水浴加熱3 h，30 min混勻一次，取出冷卻后轉移到100 mL 容量瓶中，定容至刻度線，搖勻；取1 mL 樣品溶液離心后過0.22 μm 微孔濾膜，用于高效液相分析；每次進樣10 μL，在260 nm 波長紫外燈下檢測，每份樣品重復測定3 次（李娟等，2012）。

1.2.6 正交試驗 通過正交試驗對二次發酵的主要影響因素發酵時間、米基添加量、接種量以及適當添加尿素等（汪倫記等，2012；焦靜等，2012；楊麗英等，2008）進行篩選，找出顯著性高的影響因素。 試驗對米基添加量、接種量、發酵時間進行3因素3 水平L9（34）正交試驗設計，以粗蛋白質含量為檢測指標進行試驗研究。 因素水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平

根據正交試驗設計法得到3 因素3 水平L9（34）正交試驗設計表（表2）。 根據設計試驗，每個試驗號做3 組平行處理，共27 組試驗。

表2 L9（34）正交試驗設計

2 結果與分析

2.1 發酵菌種的確定 使用10%半固體米基分別接種1%（m/m） 酵母菌、 嗜酸乳桿菌或混合菌（酵母菌：嗜酸乳桿菌=1：1），培養24 h 后進行菌落計數。 對照組則采用生理鹽水稀釋至適宜濃度后進行菌落計數。 通過比較試驗組和對照組菌體生長狀況， 篩選出適用于此種培養基的最佳發酵菌種（江成英等，2018）。一次發酵試驗的菌落計數結果見表3，從表中可以看出，三種發酵菌種方案中， 只有酵母菌在米基培養基中較對照組的菌落總數有所提高， 且廢棄米基發酵前pH 為4.9，符合酵母菌發酵適宜pH 范圍， 因此選擇酵母菌作為最終的發酵菌種。

表3 發酵菌種菌落總數計數結果

2.2 一次發酵主要影響因素的確定 主要考察了添加量分別為7.5%、10%、12.5%（m/m） 的半固體米基，接種量為1%（m/m）發酵培養24 h 對菌落總數的影響。結果如表4 所示。三個米基添加量發酵得到的菌種菌落計數均有提高，10%米基添加量的培養基干濕度適中， 營養成分足夠且有一定流動性，菌落計數最高，適用于酵母菌發酵，因此米基選用10%添加濃度。

表4 一次發酵米基添加量對菌落總數的影響

確定好米基最適添加量后， 考察發酵時間對菌落總數的影響。 從第10 小時開始，每隔2 h 觀察菌落生長狀況，保證菌種正常生長繁殖。選用在菌絲生長出前1 h 作為一次發酵的最適時間，經過試驗得出最佳一次發酵時間為20 h。

2.3 二次發酵主要影響因素的確定 正交試驗結果如表5 所示， 并由表7 和表8 的極差分析和方差分析可知，當因素為B（接種量）時極差最大，FB 值大于F 0.05（2，2），且水平在k2時出現最大值。 因此各影響因素中對粗蛋白質含量影響最顯著的是因素B（接種量），最佳接種量為6%；其次影響顯著的因素是時間； 米基添加量對粗蛋白質含量影響最小，以12.5%米基添加量為最佳。

表5 L9（34）正交試驗結果與極差分析

表6 L9（34）正交試驗方差分析

2.4 二次發酵單因素考察

2.4.1 米基添加量及發酵時間的確定 利用廢棄米基和水配制成米基占總體積7.5%、10%、12.5%的廢棄米基培養基，經121 ℃高壓滅菌15 min 作為二次發酵的培養基， 一次發酵得到的菌液作為二次發酵的母液， 以6%接種量接入到二次發酵培養基中， 放入28 ～30 ℃恒溫箱中分別發酵培養24、48、72 h 后，于烘箱中60 ℃烘干，冷卻后粉碎，測定各項指標。 以粗蛋白質含量作為指標，結果如圖1 所示。從圖中可以看出，在米基添加量為12.5%，發酵時間為48 h 時，粗蛋白質含量最高。因此二次發酵的米基添加量和時間初步確定為12.5%米基添加量，發酵48 h。

圖1 二次發酵米基添加量和時間對發酵的影響

2.4.2 接種量對發酵結果的影響 通過正交試驗結果可知接種量對于發酵的影響最顯著。 在一次發酵前期試驗的基礎上， 進行二次發酵接種量的確定，選取接種量為2%、4%、6%、8%、12%這5 個梯度進行試驗， 并通過測定粗蛋白質含量確定最佳的接種量。試驗結果如圖2 所示。從圖中可以看出，接種量為6%時粗蛋白質含量達到最大，隨后便隨接種量增大逐漸降低。因此，確定二次發酵接種量6%為最佳。

圖2 接種量對發酵結果的影響

2.4.3 添加尿素對發酵結果的影響 作為畜禽飼料， 粗蛋白質含量是一項重要的指標（李勁松等，2018），而外加氮源不僅能影響菌種的生長發育，還能夠有效提高粗蛋白質含量，因此發酵過程中尿素的添加量也是一項重要因素。本試驗在前期試驗基礎上， 分別在二次發酵培養基中添加0.1%、0.5%、1%、2%、4%尿素（m/m），發酵48 h 后，粗蛋白質含量如圖3 所示。粗蛋白質含量隨著尿素添加量的增加而增大，但過大的尿素濃度會影響菌種的正常發育，因此綜合考慮，尿素添加量為2%。

圖3 尿素添加量對發酵結果的影響

2.5 發酵產物營養與衛生指標檢測 根據試驗最終得出廢棄米基發酵工藝的最佳發酵條件，發酵3 批次，每批次3 組平行對照，每組發酵量約500 g，經60 ℃烘干，得到粗制品進行營養成分測定，結果見表7。經過酵母菌發酵后，粗蛋白質含量增加25.61%，Ca 含量增加2.51%，P 含量增加1.61%，粗脂肪含量增加23.42%，食鹽含量增加23.4%。這說明廢棄米基中的營養成分有不同程度的增加， 發酵過程對于提升廢棄米基的營養價值有一定的作用， 可為進一步研究米基二次發酵條件提供參考。 試驗對9 批次粗制品中霉菌總數、大腸菌群和沙門氏菌進行了檢測，結果均為陰性。

表7 廢棄米基發酵前后營養成分含量%

2.6 發酵產物中蟲草素的含量測定 依據標準品分析的測定結果， 測得蟲草素濃度與峰面積的標準曲線方程為：y＝36.819x-15.265（r2＝0.9996），在1 ～20 μg/mL 內線性關系良好，蟲草素標準品HPLC 圖見圖4-B。 發酵產物以及空白米基HPLC圖見圖4-C、圖4-A。 6 份樣品蟲草素含量測定結果見表8，與發酵前米基中蟲草素含量相比，經發酵后蛹蟲草廢棄米基中保留了蟲草素， 并且發酵過程對蟲草素沒有影響， 這對廢棄米基作為一種新型發酵飼料具有極大價值。

圖4 發酵產物中蟲草素含量測定

表8 發酵產物蟲草素的含量測定結果（n=3）

3 討論

本試驗通過對廢棄米基的二次發酵， 優化確定了一套廢棄米基發酵的最適條件：以釀酒酵母為發酵菌種，一次發酵米基添加量為10%（m/m），接入1% （m/m）酵母菌，30 ℃發酵20 h；二次發酵米基添加量為12.5%（m/m），接入6%（m/m）一次發酵酵母混合物，2%尿素添加量，30 ℃發酵48 h。發酵過程中應注意衛生問題，并隨時排查雜菌污染。

發酵過程中最關鍵的就是發酵菌種的選擇，優良的菌種能保證發酵飼料產品的質量， 且最大量地提高飼料中的菌體蛋白。 發酵菌種應該具有以下特性：（1）有較強的環境適應性，能在以原料為培養基的環境中正常生長；（2）繁殖速度快，產蛋白效率高；（3）自身及代謝產物無毒無致病性。 其次，在生產中接種量也很關鍵，接種量過小，發酵菌種發育緩慢，接種量過大，易導致發酵菌種生長過快，營養物質過快消耗，影響菌種正常發育。 因此確定最佳的接種量是發酵試驗成功的重要一步。

有報道稱，將發酵后的米基飼料添加到日糧中，可一定程度地提高蛋雞日糧營養物質含量，滿足蛋雞每日所需的營養物質 （李勁松等，2018；吳良柱等，2009）。 本試驗通過對廢棄米基進行發酵，發現廢棄米基中的粗蛋白質、無機物Ca、P 等營養物質的含量均有所提高， 且保留了蛹蟲草廢棄米基中特有的蟲草素， 發酵產物顏色棕黃色，具有酒香味，氣味和色澤均較發酵前有所改善。 蛹蟲草廢棄米基作為目前一種產量大，利用率低的生物資源，如果能夠對其深入研究，對于開發天然、綠色、抗病的新型飼料，減少抗生素的濫用（邵建忠等，2017）及環境污染等，具有重要意義。