2019新型冠狀病毒核酸檢測體系性能驗證

吳 劍 龔純?nèi)?傅后榜 龔 虹 張恒超 支林俊 徐 媛 劉 宇

福建省邵武市立醫(yī)院檢驗科,福建省邵武市 354000

自2019年12月以來，2019-nCoV所造成的疫情已對全球公共衛(wèi)生安全造成了巨大的威脅，給全世界的政治、經(jīng)濟帶來了巨大壓力。在2019-nCoV所導致的冠狀病毒病(COVID-19)疫情阻擊戰(zhàn)中，新冠病毒核酸檢測成了疫情排查的重要手段。在國家衛(wèi)健委發(fā)布的多版新冠病毒肺炎診療指南中均將實時熒光RT-PCR 檢測新型冠狀病毒核酸陽性作為診斷COVID-19的“金標準”[1]。依據(jù)國務(wù)院應(yīng)對新型冠狀病毒肺炎疫情聯(lián)防聯(lián)控機制醫(yī)療救治組發(fā)布的《醫(yī)療機構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊(試行第二版)》中“實驗室質(zhì)量控制與管理”對性能驗證的要求[2]，為評估本實驗室的新冠核酸檢測體系是否能在質(zhì)量上滿足臨床的需要，參照CNAS-GL02《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則》(ISO15189：2007)對醫(yī)學實驗室檢測系統(tǒng)性能評價的相關(guān)要求，結(jié)合CNAS-GL039《分子診斷檢驗程序驗證指南》對本實驗室采用的新冠核酸檢測體系進行性能驗證實驗。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 陽性樣本：2019-nCoV核酸檢測試劑盒內(nèi)陽性對照品(四川邁克生物股份有限公司，批號：0121101，-20℃保存)；第三方新型冠狀病毒核酸檢測弱陽性質(zhì)控品(北京康徹斯坦生物科技有限公司，批號：202012008，濃度：1 000copies/ml，-20℃保存]；新型冠狀病毒核糖核酸基因組標準物質(zhì)[中國計量科學研究院，編號：GBW(E)091098，批次編號：2001，定值日期：2020年2月27日，-70℃保存]。陰性樣本：健康人陰性標本。所有樣本均一次凍融。

1.2 試劑與儀器 采樣管(滅活型，康康醫(yī)療器械，規(guī)格DVSI-3.0-1，批號：210124)，內(nèi)含RNA保存液。核酸提取試劑盒(重慶中元匯吉生物技術(shù)有限公司，批號：5101143)，2019-nCoV核酸檢測試劑盒(四川邁克生物股份有限公司，批號：0121101)，全自動核酸提取儀(山東博科BK-HS32)，實時熒光定量PCR分析儀(羅氏LightCycler480II)。

1.3 方法

1.3.1 檢驗原理。磁珠法提取出新冠病毒核酸后，利用針對2019-nCoV(ORF1ab/E/N基因)設(shè)計的特異性引物和熒光探針，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)，通過監(jiān)測熒光信號的變化實現(xiàn)對新冠病毒核酸的定性檢測。

1.3.2 反應(yīng)體系。qRT-PCR反應(yīng)液17μl與qRT-PCR酶混合液3μl共同組成qRT-PCR混合液，加入已提取出的待測核酸或處理好的質(zhì)控品20μl，形成終體積為40μl的樣本，以含有內(nèi)參檢測基因的RNA假病毒為內(nèi)對照，F(xiàn)AM通道采集ORF1ab基因熒光信號，ROX通道采集E基因熒光信號，CY5通道采集N基因熒光信號，VIC通道采集內(nèi)對照熒光信號。結(jié)果判斷：根據(jù)試劑說明書中所說明的擴增曲線及循環(huán)閾值(Ct值)進行判讀。

1.3.3 陰陽性符合率驗證。陽性符合率：20例添加新型冠狀病毒核糖核酸基因組標準物質(zhì)的臨床樣本作為真實臨床陽性樣本的替代，其中10例配制為接近1.5倍最低檢測限濃度水平(750copies/ml，編號P1～P10)，另10例配制為接近4倍最低檢測限濃度水平(2 000copies/ml，編號P11～P20)；陰性符合率：20例陰性樣本為健康人陰性樣本。根據(jù)檢測結(jié)果與臨床判斷是否一致，計算陽性、陰性符合率，若≥95%，則該檢測體系的陰陽性符合率能達到要求。

1.3.4 精密度驗證。批內(nèi)精密度：同一天內(nèi)分別同時分析試劑盒內(nèi)陽性對照與第三方弱陽性質(zhì)控品，每個樣本重復檢測20次，收集實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以變異系數(shù)(CV)≤5%為合格標準；批間精密度：每天分析試劑盒內(nèi)陽性對照與第三方弱陽性質(zhì)控品，每個樣本重復檢測4次，連續(xù)測定5d，收集實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以變異系數(shù)(CV)≤5%為合格標準。

1.3.5 最低檢測限驗證。將新型冠狀病毒核糖核酸基因組標準物質(zhì)用采樣管內(nèi)RNA保存液稀釋至2019-nCoV核酸檢測試劑盒廠家聲明的最低檢測限濃度(500copies/ml)，每個基因使用檢測體系重復提取、擴增10次，≥95%樣本檢測呈陽性，則最低檢測限驗證通過。

1.3.6 交叉反應(yīng)驗證。考慮核酸序列具有同源性，將易引起相同或相似臨床癥狀的其他病原體及人基因組DNA，包括：人冠狀病毒 HCoV-229E(1.0×104～1.0×105copies/ml)、人冠狀病毒 HCoV-OC43(1.0×104～1.0×105copies/ml)、人冠狀病毒 HCoV-HKU1(1.0×104～1.0×105copies/ml)、人冠狀病毒 HCoV-NL63(1.0×104～1.0×105copies/ml)、人冠狀病毒 MERS-Cov(1.0×104～1.0×105copies/ml)、EB病毒(1.0×104～1.0×105copies/ml)、甲型流感病毒(5.4×106copies/ml)、乙型流感病毒(2.5×106copies/ml)、人副流感病毒Ⅰ型(2.4×106copies/ml)、人巨細胞病毒(1.8×103IU/ml)、肺炎支原體(1.0×106～1.0×107copies/ml)、腺病毒Ⅰ型(1.0×104～1.0×105copies/ml)、人基因組DNA定量標準物質(zhì)(3.59×104copies/μl)，對以上樣本利用本核酸檢測體系提取、擴增，進行交叉反應(yīng)驗證，結(jié)果如為陰性，表明本檢測體系與上述樣本無交叉反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 陰陽性符合率 陽性樣本的ORF1ab基因、N基因與E基因的Ct值均<37，判斷為陽性結(jié)果，陽性符合率100%(見圖1)；陰性樣本未出擴增曲線及Ct值，陰性符合率100%。

圖1 陽性樣本ORF1ab基因、N基因與E基因的Ct值

2.2 精密度 陽性對照與弱陽性質(zhì)控品ORF1ab基因、N基因與E基因的批內(nèi)精密度(見表1)CV≤5%，批間精密度(見表2)CV≤5%，該檢測體系精密度符合要求。

表1 弱陽性質(zhì)控品與陽性對照ORF1ab基因、N基因與E基因批內(nèi)精密度

表2 弱陽性質(zhì)控品與陽性對照ORF1ab基因、N基因與E基因批間精密度

2.3 最低檢測限 新型冠狀病毒核糖核酸基因組標準物質(zhì)稀釋至2019-nCoV核酸檢測試劑盒廠家聲明的最低檢測限濃度(500copies/ml)的每個基因重復提取、擴增10次，每次均出現(xiàn)了擴增曲線，Ct值均<37，判斷為陽性，檢出率100%，廠家申明的最低檢出限得到驗證(見表3、圖2～4)。

圖2 標準物質(zhì)稀釋至500copies/ml，ORF1ab基因擴增曲線

表3 標準物質(zhì)稀釋至500copies/ml，ORF1ab基因、N基因與E基因擴增結(jié)果

2.4 交叉反應(yīng) 對人類冠狀病毒(HKU1、OC43、NL63和229E)、MERS冠狀病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人副流感病毒Ⅰ型、腺病毒Ⅰ型、EB病毒、人巨細胞病毒、肺炎支原體及人基因組DNA進行檢測，結(jié)果均為陰性，本檢測體系對上述樣本無交叉反應(yīng)，特異性好(見表4)。

表4 交叉反應(yīng)驗證結(jié)果

3 討論

2019-nCoV屬于冠狀病毒科，β冠狀病毒屬，直徑為60～140nm[3]的單股正鏈RNA病毒。2019-nCoV經(jīng)呼吸道飛沫、接觸或氣溶膠[4]等傳播途徑入侵機體后與細胞表面ACE2受體結(jié)合而進入宿主細胞，復制增殖，從而導致以發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難與乏力為主要表現(xiàn)的臨床癥狀[5-8]，約20%的患者會進展為多器官功能障礙[7，9-10]。

核酸檢測作為COVID-19疫情排查的工作重點之一，質(zhì)量保證尤為重要。有研究表明[11]不同的新冠核酸檢測試劑對樣本的檢測能力存在差異。新冠核酸檢測所包含的試劑儀器有采樣管、核酸提取試劑、核酸擴增試劑及相應(yīng)的儀器，其中任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，均會影響新冠核酸檢測的結(jié)果。采樣管中的病毒保存液分為滅活型與非滅活型，滅活型主要是在病毒保存液中添加胍鹽，有研究標明[12]胍鹽滅活導致的假陰性更少，但另有研究表明，胍鹽的濃度是否合適，對提取效果的影響非常大[13]。核酸提取在新冠核酸檢測中的作用不可輕視，是檢測結(jié)果精密度的重要保證[14]。用于新冠核酸提取的方法主要有磁珠分離法、離心柱法與一步法，目前實驗室最常用的核酸提取方法是磁珠分離法，但據(jù)中國海洋大學的研究人員研究表明:不同的磁珠對標本的親和性不同[15]，因此，不同的提取試劑根據(jù)其標本、磁珠、試劑用量及洗滌次數(shù)的不同，提取效能是有差異的。目前各醫(yī)療機構(gòu)新冠核酸擴增主要運用反轉(zhuǎn)錄PCR擴增(RT-PCR)與等溫擴增兩種技術(shù)，兩種方法各具優(yōu)勢：RT-PCR技術(shù)成熟度最高，應(yīng)用最為廣泛，而等溫擴增不需要反復升降溫就可實現(xiàn)核酸的擴增，可以達到快速檢測的目的。綜上所述，在核酸采樣、提取與檢測過程中的每一步，都會影響到檢測質(zhì)量，因此，選擇配套儀器試劑時，性能驗證是非常重要的一環(huán)。

圖3 標準物質(zhì)稀釋至500copies/ml，N基因擴增曲線

圖4 標準物質(zhì)稀釋至500copies/ml，E基因擴增曲線

經(jīng)本次性能驗證發(fā)現(xiàn)，本實驗室采用的康康醫(yī)療器械生產(chǎn)的采樣管、重慶中元匯吉生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑(磁珠法)，四川邁克生物股份有限公司生產(chǎn)的2019-nCoV核酸檢測試劑盒與山東博科生產(chǎn)的全自動核酸提取儀(BK-HS32)及羅氏公司的實時熒光定量PCR分析儀(LightCycler480II)在2019-nCoV核酸檢測配套使用時，陰陽性符合率一致，重復性好，最低檢測限與廠家聲明一致，與能引起相同或相似臨床癥狀的其他病原體及人基因組DNA不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性好，能夠在質(zhì)量上保證臨床新冠核酸檢測的需要，可為其他實驗室選擇檢測體系配套方案提供參考依據(jù)。但本研究僅對檢測體系的一個批號進行驗證，并且本實驗室自開展新冠核酸檢測以來并未發(fā)現(xiàn)陽性病例，未采用真實陽性臨床樣本進行性能驗證，故后續(xù)還應(yīng)對不同批號做性能測試，且與多家實驗室進行結(jié)果比對。