基于網絡藥理學探討龍血竭治療潰瘍性結腸炎的作用機制*

蔡碧蓮，文亦磊

(1.廣西中醫學校，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院病理科，廣西 南寧 530023)

潰瘍性結腸炎是一種尚未明確病因的慢性非特異性炎性腸病，主要表現為腹痛、黏液膿血便伴里急后重，病變累及部位主要為結直腸黏膜層和黏膜下層。因此，治療該病的關鍵之處在于保護腸黏膜屏障、止血、修復腸壁潰瘍等。龍血竭是一種經植物劍葉龍血樹提取的樹脂，具有活血散瘀、定痛止血、斂瘡生肌等功效[1]，與現代醫學治療潰瘍性結腸炎原則不謀而合。但目前對龍血竭的藥理作用機制尚未深入研究，其效應成分也未見明確的文獻報道。本研究通過網絡藥理學篩選了龍血竭有效成分、作用靶點及信號通路，從而構建龍血竭對治療潰瘍性結腸炎的“成分-靶點-疾病”網絡，闡明龍血竭治療潰瘍性結腸炎的基本作用機制，以期為開發龍血竭資源并指導臨床應用龍血竭治療潰瘍性結腸炎提供理論依據。

1 資料與方法

1.1資料來源 全文資料均在中藥系統藥理學分析平臺數據庫(TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)、有機小分子生物活性數據庫(PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、STRING 10.5數據庫(http：//string-db.org)、GeneCards數據庫(https：//www.genecards.org/)檢索得出。

1.2方法

1.2.1龍血竭有效成分潛在靶點的篩選 以“龍血竭”為檢索詞，在TCMSP、PubChem檢索其所含的有效成分及所對應潛在靶點，以口服利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18作為篩選條件之一，剔除其中重復項及非人源的靶點，最終獲得龍血竭有效成分相關的靶點信息。

1.2.2潰瘍性結腸炎相關靶點的篩選 在GeneCards數據庫中以“潰瘍性結腸炎”為檢索詞進行相關靶點的檢索，并對重復項進行剔除，取“Relevance score”在前200個疾病相關最高的靶點。

1.2.3龍血竭與潰瘍性結腸炎相關靶點的篩選 將“1.2.1”項獲得的龍血竭有效成分潛在靶點與“1.2.2”項獲得的潰瘍性結腸炎相關靶點進行Venny2.1交集比對分析，提取共同的靶點，采用蛋白互作網絡(PPI)分析進一步明確龍血竭有效成分的潛在靶點與潰瘍性結腸炎疾病靶點的關系。

1.2.4龍血竭對潰瘍性結腸炎作用靶點的GO富集分析及KEGG富集分析 將上述靶點的簡稱以Gene Symbol格式上傳至David數據庫，進行GO富集分析、KEGG富集分析，P<0.05為差異有統計學意義。通過GO富集分析探討龍血竭有效成分治療潰瘍性結腸炎潛在作用靶點的生物過程、分子功能、細胞成分等；KEGG富集分析探討龍血竭治療潰瘍性結腸炎作用潛在靶點的通路分布。

1.2.5龍血竭“成分-靶點-通路”網絡構建及核心靶點篩選 在Cytoscape軟件中用不同顏色和形狀代表有效化學成分、作用靶點、作用通路等。用“邊”連接有效化學成分和作用靶點，以及作用靶點和其注釋的相關作用通路，由此構建“成分-靶點-通路”網絡探討龍血竭多成分、多靶點、多通路治療潰瘍性結腸炎的作用機制。

2 結 果

2.1龍血竭有效成分及有效成分潛在靶點 龍血竭主要化合物有黃酮類、查耳酮類、多聚查耳酮類、黃烷類、高異黃烷類等多種化合物。但以OB≥30%、DL≥0.18和Lipinski原則為標準最終篩選出14種化合物，其潛在作用靶點及數量見表1。龍血竭有14種化合物、90個作用靶點，得出以下結論：(1)龍血竭具有多成分、多靶點的作用特點；(2)在不同的化合物中可能存在相同的作用靶點。此網絡涉及的節點數為91個，節點與節點之間的邊數為710條，平均節點度為15.6，聚類系數為0.592。

表1 龍血竭的化合物及潛在作用靶點

續表1 龍血竭的化合物及潛在作用靶點

2.2潰瘍性結腸炎靶點與龍血竭靶點比較 通過GeneCards數據庫初步篩選出4 356個疾病候選基因，根據“Relevance score”讀取最高的前200個結果，與潰瘍性結腸炎相關發病機制靶點進行比對，得出龍血竭與潰瘍性結腸炎相關發病機制的17個作用靶點基因，進一步說明了龍血竭與潰瘍性結腸炎的靶向作用關系。龍血竭成分靶點與潰瘍性結腸炎相關發病機制靶點韋恩圖見圖1。從龍血竭有效成分對潰瘍性結腸炎的作用靶點的PPI網絡關系可知，聚類系數為0.825，平均節點度為11.765，平均最短路徑為1.625，其中17個重疊靶點是該藥與疾病作用的關鍵分子基礎，并在關系網絡中體現了較好的連通特性。

圖1 龍血竭成分靶點與潰瘍性結腸炎相關發病機制靶點韋恩圖

2.3龍血竭對潰瘍性結腸炎作用靶點的GO分析和KEGG分析 采用David數據庫篩選龍血竭對治療潰瘍性結腸炎主要涉及的內容為生物過程25個，包括一氧化氮生物合成過程的正調控、藥物反應、細胞增殖的負調控、細胞氧化解毒、凋亡過程的負調控等；細胞組成13個，包括細胞外、血小板α顆粒內腔、高爾基體、內體腔、胞外區等；分子功能16個，包括血紅素結合、受體結合、轉錄調控區 DNA 結合、蛋白磷酸酶結合、前列腺素-內過氧化物合酶活性等，差異均有統計學意義(P<0.05)。采用David數據庫篩選龍血竭對治療潰瘍性結腸炎的相關信號通路，KEGG通路富集分析結果顯示，龍血竭中90個潛在作用靶點涉及缺氧誘導因子1(HIF-1)信號通路、腫瘤信號通路、轉錄調節因子(FoxO)信號通路、炎癥性腸病信號通路、HTLV-I感染、脂肪細胞中脂解的調節、產生免疫球蛋白A的腸道免疫網絡等25條通路。

2.4龍血竭“成分-靶點-通路”網絡分析及核心靶點 采用Cytoscape3.6.1軟件構建龍血竭治療潰瘍性結腸炎的“成分-靶點-通路”網絡，從該網絡可知，龍血竭預測出的14種有效成分，14種有效成分預測出的90個潛在靶點，90個潛在靶點與潰瘍性結腸炎的25條交集通路。該網絡涉及129個節點，514條邊，平均最短路徑為3.62，平均節點度為3.98，平均中心接近度為0.29，網絡中心度為4.05。

3 討 論

潰瘍性結腸炎的發生與發展受多種因素、多種細胞和多條信號通路的調控而形成的復雜生物學過程[2]。網絡藥理學通過篩選藥物活性成分、靶點，構建“成分-靶點”網絡；對疾病發病機制靶點核查對比，構建“成分-靶點-疾病”網絡；并構建“成分-靶點-通路”網絡的體系。網絡藥理學從傳統的“單靶點、單通路”的研究角度轉變為“多成分、多靶點、多通路”的研究理念與方法[3]。從而闡明中藥成分、靶點、疾病之間的網絡關系，為中醫藥科學內涵提供了理論依據及新的研究思路。

本研究通過網絡藥理學方法預測了龍血竭治療潰瘍性結腸炎的有效成分和藥物靶點蛋白，并與潰瘍性結腸炎發病機制的靶點核查對比的靶點而得到的交互蛋白，從而構建“成分-靶點-疾病”網絡。通過篩選得到的這些蛋白——IL-6、SMAD3、STAT3、干擾素均與潰瘍性結腸炎密切相關。并且在KEGG富集通路分析所獲取的“成分-靶點-通路”中，通過查閱文獻可知，這些通路與炎性反應有直接或間接的關系，作者考慮龍血竭主要通過影響這些炎癥通路，從而發揮治療潰瘍性結腸炎的作用。此外，近年來對潰瘍性結腸炎相關的信號通路的研究表明，與潰瘍性結腸炎具有相關性的通路有腫瘤信號通路[4-5]、炎癥性腸病信號通路[6-7]、HIF-1信號通路[8-9]、FoxO信號通路[10]、腫瘤壞死因子信號通路[11]、Jak-STAT信號通路[12]和磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號通路[13]。

作為一種輔助性T淋巴細胞1型促炎性細胞因子的IL-6，是由單核細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞分泌的，在免疫調節、炎性反應、腫瘤發生等過程中具有重要作用。IL-2作為其中的一種抑炎性細胞因子，通過誘導淋巴細胞分化、增殖，增強自然殺傷細胞和T淋巴細胞活性，促進B淋巴細胞分化、增殖，從而調節免疫系統，延緩或阻止潰瘍性結腸炎的發生與發展。原本靜息態的信號傳導蛋白和STAT3在某些因素的刺激下轉變為活化STAT3，是潰瘍性結腸炎的發生與發展不可或缺的重要分子，若活化STAT3出現過表達還可使炎癥向腫瘤轉化[14]。有研究通過三硝基苯磺酸/乙醇法構建了大鼠潰瘍性結腸炎模型，治療組予以甘草瀉心湯各劑量灌胃治療，與模型組比較，甘草瀉心湯各劑量組血清谷草轉氨酶水平均降低，甘草瀉心湯中劑量組結腸組織病理評分明顯降低，結腸組織中IL-6、STAT3蛋白及mRNA表達均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。表明甘草瀉心湯可能是通過降低結腸組織中IL-6、STAT3的表達，抑制IL-6/STAT3信號傳導通路，改善潰瘍性結腸炎大鼠的結腸結構[15]。翟月華等[8]觀察了自擬清腸愈瘍湯經驗方口服、中藥灌腸對重度潰瘍性結腸炎患者腸道菌群、血清HIF-1α、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、β-內啡肽(β-EP)水平的影響。結果顯示，觀察組患者血清HIF-1α、TGF-β1、β-EP水平降低程度明顯優于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。表明重度潰瘍性結腸炎患者經自擬清腸愈瘍湯經驗方口服、中藥灌腸進行中醫內外合治能改善其臨床癥狀。考慮可能是與抑制血清HIF-1α、TGF-β1、β-EP過表達而實現修復腸黏膜上的潰瘍，使之愈合并恢復其屏障功能。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學得知，龍血竭有14種有效成分可直接或間接地作用于IL-6、SMAD3、STAT3、干擾素等90個核心靶點，并富集到腫瘤信號通路、炎癥性腸病信號通路、HIF-1信號通路、FoxO信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、Jak-STAT信號通路和磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號通路上，相互協調，通過多種途徑發揮保護腸黏膜和修復腸壁潰瘍的作用。本研究初步揭示了龍血竭治療潰瘍性結腸炎可能的網絡，為龍血竭治療潰瘍性結腸炎的進一步實驗研究及臨床應用提供了參考依據。但網絡藥理學方法也存在著一定的局限性，如非核心靶點是否具有藥理作用、龍血竭在體內代謝產物是否對作用機制有影響均有待于下一步的實驗驗證。