重組人血清淀粉樣蛋白分離純化及穩(wěn)定性研究

唐 艷，王偉穎，劉永東，陳文瓊△

（1.四川省樂山市人民醫(yī)院，四川 樂山 614000； 2.中國科學(xué)院過程工程研究所，北京 100190）

血清淀粉樣蛋白A（SAA）主要由肝細(xì)胞分泌，是血液循環(huán)中參與高密度脂蛋白（HDL）運(yùn)輸?shù)囊活愝d脂類蛋白［1］，在不同脊椎動(dòng)物中編碼SAA 的基因具有高度同源性［2］。編碼人血清淀粉樣蛋白（HSAA）的基因組有4 種，分別為ssa1，ssa2，ssa3，ssa4。其中，ssa1 和ssa2 基因編碼功能蛋白為SAA1和SAA2，ssa4基因編碼重要的結(jié)構(gòu)蛋白為SSA4，而ssa3 為不表達(dá)蛋白的假基因［3］。成熟的人SAA1 單體（HSSA1）由104 個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為12 000［4］，其二級(jí)結(jié)構(gòu)由4個(gè)α螺旋和1個(gè)C端尾巴構(gòu)成［5］。除參與脂質(zhì)代謝和運(yùn)輸外，SAA 在細(xì)菌清除、炎性調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生等生理過程中發(fā)揮著重要作用。作為機(jī)體內(nèi)的一種重要調(diào)節(jié)素，SAA1 不僅能結(jié)合視黃醇抵抗細(xì)菌感染［6］，還能有效促進(jìn)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)革蘭陰性菌的提取和吞噬作用［7］。此外，SAA1也是人體內(nèi)的一種重要急性期蛋白，在急性炎性反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用［8］。通常情況下，SAA1蛋白在血液內(nèi)的質(zhì)量濃度維持在1～3 μg/ mL 的較低水平，機(jī)體受到組織損傷、創(chuàng)傷、感染等炎性刺激后的24 h內(nèi)，由肝細(xì)胞分泌進(jìn)入血液的SAA1 濃度會(huì)大幅提高至正常水平的1 000 倍，炎癥消除后，SAA1 濃度又恢復(fù)到正常水平。近年來，SAA1 常被用作人類炎性疾病的重要臨床指標(biāo)［9-10］。SAA 在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和心腦血管疾病的形成中發(fā)揮著重要作用［11］，宮頸癌患者體內(nèi)SAA1 和SAA4 蛋白含量大量增加［12］，接受表皮生長(zhǎng)因子（EGF）受體酪氨酸激酶抑制劑治療的非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)血漿的SAA1 水平也明顯升高［13］，血漿中SAA1 升高也是心血管等疾病的重要致病因素［14-16］。因此，SAA1 也被用作腫瘤檢測(cè)、心血管疾病等的生物標(biāo)志物，預(yù)后及后續(xù)治療效果的判定指標(biāo)。SAA1 蛋白在體內(nèi)參與了多種疾病的發(fā)生與發(fā)展，但其發(fā)揮作用的機(jī)制尚未明確，在體外對(duì)于SAA1 蛋白功能、檢測(cè)手段及相關(guān)抗體的研究也存在大量問題亟待解決，故制備高純度、高穩(wěn)定性的SAA1 蛋白尤為重要［17-20］。本研究中采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)以可溶形式表達(dá)重組HSAA1，利用一步層析純化，成功獲得了純度大于95%的SAA1 蛋白，并初步考察其儲(chǔ)存的穩(wěn)定性，為SAA1 用于免疫檢測(cè)試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)品及相關(guān)抗體的開發(fā)提供基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑、蛋白與菌株

儀器：Mili - Q 型純水儀器（密理博＜中國＞有限公司）；BT124 S型分析天平（德國Sartorius公司，精度為0.01 g）；Mini Ⅲ型電泳儀（美國Bio - Rad 公司）；JY98型超聲破碎儀（上海測(cè)博生物科技有限公司，功率為1 200 W，頻率為19.5～20.5 kHz）；UV755 型紫外可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；J - 810 型圓二色光譜儀（日本JASCO 公司）；?KTA Purifier 10 型層析設(shè)備（美國GE Healthcare公司）。

試劑：苯甲基磺酰氟（PMSF，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)為20200612）；其余試劑均為分析純。

蛋白：蛋白質(zhì)Marker（日本Takara Bio 公司）；HSAA1 標(biāo)準(zhǔn)品（南京歐凱生物有限公司，純度為99%）；兔抗人SAA1 多抗（金斯瑞生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（Proteintech Group Inc.）。

菌株：大腸桿菌E.coli BL21（DE3）菌株、大腸桿菌DH5α 菌株P(guān)ET28a 質(zhì)粒，購于中美泰和生物科技有限公司。

1.2 菌種構(gòu)建

采用全基因合成法合成SAA1 氨基酸序列，選用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ，將SAA1 基因片段連接至pET28a質(zhì)粒。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Luria - Bertani（LB）固體培養(yǎng)基（100 μg/mL 氨芐青霉素），37 ℃過夜培養(yǎng)，次日挑取單個(gè)圓潤(rùn)菌落，接種于LB 培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，取1 μL 菌液作鑒定。將測(cè)序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站（https：/ /submit.ncbi.nlm.nih.gov/）中查到的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，確定序列正確的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌E.coli BL21（DE3）細(xì)胞，獲得重組工程菌。

1.3 誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定

將保存的SAA1甘油菌按0.2%接種量接種于50 mL LB 液體培養(yǎng)基中（100μg/mL 氨芐霉素），37 ℃溫度條件下活化過夜培養(yǎng)。將活化后的菌體按1%接種量接種于500 mL LB 液體培養(yǎng)基中（100μg/mL 氨芐青霉素），37 ℃溫度條件下擴(kuò)大培養(yǎng)4 h，于600 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，吸光度達(dá)1.0后加入0.5 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），誘導(dǎo)表達(dá)，4 h 后采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳技術(shù)確定目的蛋白是否表達(dá)。

1.4 菌體收集及破菌

用菌體質(zhì)量10倍體積的破菌液（pH 8.0，20 mmol/L tris-HCl 緩沖液）重懸菌體后，將菌體置冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，破碎后離心（溫度為4 ℃，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min）30 min，分別收集上清液和沉淀，采用SDS-PAGE 凝膠電泳技術(shù)確定目的蛋白是否可溶性表達(dá)。

1.5 層析純化

層析純化前，先采用硫酸銨沉淀法對(duì)破菌后上清液進(jìn)行預(yù)處理。取破菌后上清液，加入硫酸銨至1.5 mmol/L，于4 ℃放置30 min，離心（轉(zhuǎn)速為12 000 r/min）30 min，離心后的沉淀用含有8 mmol/ L 脲的緩沖液重懸，離心（溫度為4 ℃，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min）30 min；離心上清液用SP FF 陽離子交換層析對(duì)重組SAA1 進(jìn)行純化，緩沖液A 為20 mmol/ L HAc - NaAc（pH 4.0），緩沖液B 為20 mmol/L HAc-NaAc+1 mol/L NaCl（pH 4.0）。純化時(shí)先用緩沖液平衡層析柱，上樣結(jié)束用緩沖液A進(jìn)行淋洗，再用100%緩沖液B進(jìn)樣洗脫。收集目的蛋白洗脫峰，透析至20 mmol/L Tirs-HCl緩沖液（pH 7.5）中，并采用SDS-PAGE凝膠電泳技術(shù)確定純化后的蛋白純度。

1.6 蛋白結(jié)構(gòu)表征

采用J - 810 型圓二色光譜儀分析透析后重組SAA1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，檢測(cè)時(shí)蛋白濃度約為0.2 mg/mL，所用比色皿光徑為1 mm，掃描波長(zhǎng)范圍為190～260 nm，在室溫下檢測(cè)，以相應(yīng)緩沖液為空白對(duì)照，檢測(cè)樣品時(shí)扣除空白對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.7 免疫活性考察

采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法進(jìn)一步考察純化并復(fù)性后的重組HSAA1 的活性，并與HSAA1 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比。以購買的HSAA1標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)抗原，實(shí)驗(yàn)室純化的重組HSAA1 蛋白作為樣品抗原，用抗原稀釋緩沖液進(jìn)行稀釋，以每孔0.001～0.250 μg 的量包被96 孔板，每孔加入100μL稀釋后的抗原溶液，37 ℃孵育2 h，倒掉包被液，用磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗滌4 次，拍干板子；每孔加入120μL 3%牛血清蛋白，37 ℃孵育2 h，以封閉板子上未與抗原結(jié)合的位點(diǎn)，倒掉封閉液；用PBST洗滌4次，并拍干板子，每孔加入100μL質(zhì)量濃度為0.4 μg/ mL 的一抗，37 ℃孵育2 h，倒掉一抗；用PBST 洗滌4 次，拍干板子，每孔加入100 μL 以1∶1 000稀釋的二抗（以產(chǎn)品說明書為準(zhǔn)），37 ℃孵育2 h，倒掉二抗；用PBST 洗滌4 次，拍干板子，每孔加入100μL 顯色液，室溫反應(yīng)10 min，每孔加入50μL 1 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)，室溫反應(yīng)10 min，利用酶標(biāo)儀于450 nm 和630 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行雙波長(zhǎng)比色。

1.8 穩(wěn)定性考察

將復(fù)性后的SAA1分別置換至以下5種緩沖液體系中：20 mmol/ L HAc - NaAc（pH 4.5），20 mmol/ L PB（pH 7.4），20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0），含有25%甘油的20 mmol/L Tris- HCl 緩沖液（pH 8.0），含有50%甘油的20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）。將上述5 種樣品置4 ℃和室溫下，分別于0，10，30，90 d取樣，采用16% Tricine-SDS-PAGE 凝膠電泳技術(shù)確定目的蛋白的降解情況，并考察其在不同緩沖條件及溫度下的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 重組HSAA1 原核表達(dá)和鑒定

利用LB 培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)重組HSAA1，誘導(dǎo)前后全菌、破菌上清液及沉淀的電泳結(jié)果見圖1。SAA1理論相對(duì)分子質(zhì)量為12 000，誘導(dǎo)后的全菌、破菌上清液和破菌沉淀均出現(xiàn)了相對(duì)分子量為12 000 的條帶，但此條帶并未在誘導(dǎo)前全菌中出現(xiàn)，說明構(gòu)建的重組大腸桿菌能有效表達(dá)SAA1。比較破菌后離心的上清液和沉淀的電泳條帶可發(fā)現(xiàn)，SAA1 主要存在于破菌后的上清液，少量存在于破菌沉淀中，說明重組SAA1主要為可溶性表達(dá)。

2.2 純化及表征

M.蛋白Marker 1.誘導(dǎo)前全菌 2.誘導(dǎo)后全菌3.誘導(dǎo)后破菌上清液 4.誘導(dǎo)后破菌沉淀圖1 重組HSAA1誘導(dǎo)表達(dá)及破菌前后SDS-PAGE電泳圖M.Protein Marker 1.Whole cell before induction 2.Whole cell after induction 3.Supernatant for cell disruption after induction 4.Precipitation for cell disruption after inductionFig.1 SDS-PAGE electrophoretogram before and after inducedexpression of recombinant HSAA1 and cell disruption

首先，在破菌后離心上清液中加入終濃度為1.5 mmol/L的硫酸銨，對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行富集及初步純化，電泳結(jié)果（見圖2條帶2）表明，目標(biāo)蛋白在含有1.5 mmol/L硫酸銨溶液中全部沉淀。利用硫酸銨粗純化，能去除一部分分子量較大的雜質(zhì)，但效果不明顯，仍需進(jìn)行層析純化。SAA 在體外未與HDL 結(jié)合，具有形成三聚體、六聚體等低聚物的傾向［17］，多種結(jié)構(gòu)共存不利于直接純化。故本研究中采用8 mmol/L 脲重懸硫酸銨沉淀產(chǎn)物，將目標(biāo)蛋白完全變性為單體后，再進(jìn)行層析純化。SP FF層析純化結(jié)果見圖3，雜蛋白主要存在于穿過峰中，利用NaCl階躍洗脫，洗脫峰中重組SAA1的純度在95%以上。

M.蛋白Marker 1.破菌后上清液 2.硫酸銨沉淀上清液3.8 mol/L脲重懸硫酸銨沉淀 4.SP FF穿過峰FT 5.SP FF洗脫峰P圖2 SDS-PAGE電泳圖M.Protein Marker 1.Supernatant for cell disruption 2.Supernatant after ammonium sulphate precipitation 3.Supernatant resuspended with 8 mol/L carbamide after ammonium sulfate precipitation 4.SP FF flowthrough peak F 5.SP FF elution peak PFig.2 SDS-PAGE electrophoretogram

注：*為SP FF洗脫峰P，△為SP FF穿過峰FT。圖3 SP FF層析色譜圖（λ=280 nm）Note：* refers to SP FF elution peak P，and △refers to SP FF peak F.Fig.3 Chromatogram of SP FF（λ=280 nm）

8 mmol/L 脲中的蛋白通常處于變性狀態(tài)，且無活性，為恢復(fù)目標(biāo)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和生物活性，采用截留相對(duì)分子質(zhì)量3 000 的透析袋在4 ℃條件下對(duì)SP FF 洗脫峰進(jìn)行透析，以除去洗脫峰中的脲。目標(biāo)蛋白分別在HAc-NaAc（pH 4.5）和Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液中透析的圓二色光譜圖（見圖4）。可見，2種緩沖溶液目標(biāo)蛋白均于208 nm 和222 nm 波長(zhǎng)處表現(xiàn)出2個(gè)負(fù)的特征肩峰，表明透析到2 種緩沖液中的目標(biāo)蛋白均形成了以α螺旋為主的二級(jí)結(jié)構(gòu)，均能恢復(fù)其天然構(gòu)象［5］。

圖4 透析復(fù)性SAA1的圓二色光譜圖Fig.4 CD spectroscopy of dialysis refolded SAA1

2.3 免疫活性檢測(cè)

630 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值主要用來扣除酶標(biāo)板的本底吸附，450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值才反映實(shí)際反應(yīng)的光吸收值，故僅測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度。抗原濃度和450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值間的相關(guān)性見圖5，結(jié)果表明，重組HSAA1的質(zhì)量濃度在0.01～2.50μg/mL范圍內(nèi)與吸光度值呈線性關(guān)系，與HSAA1標(biāo)準(zhǔn)品具有相似的線性趨勢(shì)，且質(zhì)量濃度為0.01μg/mL時(shí)，重組HSAA蛋白仍具有與抗體的結(jié)合能力，所得SAA1 具有良好的免疫活性和優(yōu)異的反應(yīng)靈敏度，可作為免疫學(xué)診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)品，以及用于誘發(fā)活體動(dòng)物產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。

圖5 重組HSAA1與HSAA1標(biāo)準(zhǔn)品免疫活性比較（λ=450 nm）Fig.5 Comparison of immune activity between renatured HSAA1 and HSAA1 standard（λ=450 nm）

A.20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液 B.20 mmol/L PB（pH 7.4） C.20 mmol/L HAc-NaAc（pH 4.5）D.20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液+25%甘油 E.20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液+50%甘油圖6 SAA1穩(wěn)定性考察結(jié)果A.20 mmol/L Tris-HCl buffer solution（pH 8.0） B.20 mmol/L PB（pH7.4） C.20 mmol/L HAc-NaAc（pH 4.5） D.20 mmol/L Tris-HCl buffer solution（pH 8.0）+25% glycerol E.20 mmol/L Tris-HCl buffer solution（pH 8.0）+50% glycerolFig.6 Results of the stability testing of SAA1

2.4 穩(wěn)定性考察

由圖6 可知，pH 值對(duì)SAA1 的儲(chǔ)存穩(wěn)定性有較大影響。在不同pH 值的緩沖液中，SAA1 在4 ℃的穩(wěn)定性高于室溫，室溫存放10 d 后，SAA1 在pH 8.0 和pH 7.4 的緩存液中無明顯降解，但在pH 4.5 的緩沖液中完全降解，表明SAA1 在中性及偏堿性條件下的穩(wěn)定性高于酸性條件；室溫存放30 d 后，SAA1 在pH 8.0 和pH 7.4 的緩沖液中也發(fā)生明顯降解，但4 ℃存放能延緩降解速率。在pH 8.0的緩沖液體系中添加甘油能提高SAA1的穩(wěn)定性，添加25%甘油4 ℃和室溫放置90 d后均無明顯降解，表明甘油可作為蛋白穩(wěn)定劑保護(hù)重組SAA1蛋白不被降解，且25%甘油作為穩(wěn)定劑的效果強(qiáng)于50%甘油。

3 討論

本研究中成功構(gòu)建了重組HSAA1 大腸桿菌工程菌，SAA1 主要為可溶性表達(dá)；在含脲的緩沖體系中，利用層析純化能獲得95%以上純度的SAA1；透析復(fù)性后SAA1的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α螺旋結(jié)構(gòu)，表明8 mmol/L 脲處理的SAA1 能恢復(fù)其天然結(jié)構(gòu)；重組SAA1 蛋白在質(zhì)量濃度為0.01μg/mL時(shí)仍有較高的抗體結(jié)合能力和免疫活性。相較于pH 4.5的酸性條件，中性和弱堿性條件更有利于維持SAA1 的穩(wěn)定性，加入25%甘油有利于重組蛋白在4 ℃和室溫條件下長(zhǎng)期儲(chǔ)存。25%甘油是維持重組HSAA1活性的優(yōu)良穩(wěn)定劑。本研究結(jié)果為SAA1用于免疫檢測(cè)、標(biāo)準(zhǔn)品制備、臨床檢測(cè)等奠定了良好基礎(chǔ)。