苗藥組方二巖虎果無糖顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及藥效評(píng)價(jià)*

饒 海，劉永琴，羅忠圣，3，4，梁芳瑜，徐昌艷，覃容貴△

（1.貴州省貴陽市云巖區(qū)人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550001； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué)天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550014； 4.省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

二巖虎果湯是貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院名老中醫(yī)饒?zhí)炫嗟慕?jīng)驗(yàn)方，由巖豇豆、巖白菜、虎杖、果上葉4 味苗藥組方。方中巖豇豆化痰止咳、軟堅(jiān)散結(jié)，為君藥；巖白菜收斂止瀉、止血止咳、舒筋活絡(luò)，為臣藥；虎杖利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰，為佐藥［1-2］；果上葉潤(rùn)肺止咳、消炎止痛，為使藥。全方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，共奏清肺平喘、辛涼宣肺之功效，主治風(fēng)熱犯肺、痰熱內(nèi)蘊(yùn)所致咳嗽、哮喘，臨床用于治療痰熱內(nèi)蘊(yùn)所致咳嗽、大葉性肺炎、急性支氣管炎、小兒哮喘等［3］。傳統(tǒng)二巖虎果湯在臨床以湯劑使用，但湯劑口服劑量大，患者服用依從性差，易變質(zhì)，不方便攜帶，不利于批量生產(chǎn)。故以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，依據(jù)處方藥物的功能主治及現(xiàn)代臨床用藥需要，結(jié)合藥物主要成分的性質(zhì)、技術(shù)水平、臨床用藥特點(diǎn)，將湯劑改制成攜帶方便、服用量少、服用方法與傳統(tǒng)湯劑最相似的顆粒劑［4］。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對(duì)二巖虎果無糖顆粒劑中巖豇豆、巖白菜、虎杖進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定制劑中君藥巖豇豆主要有效成分石吊蘭素的含量，建立了二巖虎果無糖顆粒劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并比較顆粒劑與傳統(tǒng)湯劑的止咳、抗炎作用，以明確其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的合理性與可行性。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

1.1 儀器

Agilent HPLC1100 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；101 - 1 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海路達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；AL204 型電子分析天平（梅特勒- 托利多儀器有限公司，精度為萬分之一）；QY-20 型三用紫外分析儀（上海市聞天儀器設(shè)備有限公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；AS系列超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；薄層層析硅膠GF254薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

甲醇（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、甲酸、濃硫酸均為分析純，水為娃哈哈純凈水；石吊蘭素對(duì)照品（批號(hào)為111555 -200602，含量以98.1%計(jì)），巖白菜素對(duì)照品（批號(hào)為111532-200202，含量以94.1%計(jì)），大黃素對(duì)照品（批號(hào)為110756-200110，含量以100%計(jì)），石吊蘭對(duì)照藥材（批號(hào)為120980 - 201005），虎杖對(duì)照藥材（批號(hào)為121297 - 201003），均購于中國(guó)食品藥品檢定研究院；復(fù)方巖白菜素片（云南明鏡享利制藥有限公司，批號(hào)為111532 - 200202，規(guī)格為每片125 mg）；阿司匹林腸溶片（江蘇平光制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)為140601，規(guī)格為每片25 mg）；二巖虎果無糖顆粒（自制，批號(hào)分別為20160701，20160702，20160703，規(guī)格為每袋15 g）；巖豇豆陰性無糖顆粒、巖白菜陰性無糖顆粒、虎杖陰性無糖顆粒（按處方分別稱取缺巖豇豆、巖白菜、虎杖的陰性顆粒）。

1.3 動(dòng)物

SPF 級(jí)健康KM 種小鼠80 只，體質(zhì)量（20 ± 2）g，雌雄各半，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（黔）2012 - 0001。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于潔凈、通風(fēng)環(huán)境中，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為21～24 ℃、相對(duì)濕度為50%～55%，飼養(yǎng)1周后使用。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

巖豇豆［1］92：取3個(gè)批號(hào)樣品1 g，共3份，研細(xì)，加入20 mL 甲醇，超聲提取30 min，過濾，蒸干殘?jiān)舆m量甲醇溶解，制得供試品溶液。分別取巖豇豆陽性無糖顆粒1 g和巖豇豆對(duì)照藥材0.1 g，同法制得陰性對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液。另取石吊蘭素對(duì)照品適量，加甲醇制得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》TLC 法，分別吸取上述6 種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，揮干溶劑，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，并于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置254 nm 波長(zhǎng)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，詳見圖1 A。

1-3.供試品溶液（批號(hào)分別為20160701，20160702，20160703）4.對(duì)照品溶液 5.對(duì)照藥材溶液 6.陰性對(duì)照品溶液A.巖豇豆（254 nm） B.巖白菜（254 nm） C.虎杖（365 nm）圖1 薄層色譜圖1-3.Test solution（batch No.：20160701，20160702，20160703）4.Reference solution 5.Reference medicinal material solution 6.Negative reference solutionA.Lysionotus Herba（254 nm） B.Bergenia Rhizoma（254 nm）C.Polygonum Cuspidatum Rhizoma et Radix（365 nm）Fig.1 TLC chromatograms

巖白菜［1］220，［5］：取3 個(gè)批號(hào)樣品1 g，共3 份，研細(xì)，加入20 mL 甲醇，超聲提取40 min，放至室溫，過濾，取濾液，制得供試品溶液。取巖白菜陰性無糖顆粒1 g，同法制得陰性對(duì)照品溶液。另取巖白菜素對(duì)照品適量，加入甲醇，制得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的對(duì)照品溶液。按2020年版《中國(guó)藥典（四部）》TLC 法，分別吸取上述5種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（4∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，揮干溶劑，置254 nm波長(zhǎng)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，詳見圖1 B。

虎杖［1］217，［6-7］：取3 個(gè)批號(hào)樣品1 g，共3 份，研細(xì)，加入20 mL 甲醇，超聲提取15 min，濾過，殘?jiān)舾蔀V液，加入2.5 mo1/L 硫酸溶液10 mL，回流提取30 min，冷卻，再用三氯甲烷提取2 次，每次5 mL，合并溶液，烘干，殘?jiān)尤燃淄? mL 使溶解，制得供試品溶液。分別取虎杖陰性無糖顆粒和虎杖對(duì)照藥材各1 g，同法制得陰性對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液。另取大黃素對(duì)照品適量，加入甲醇制得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》TLC 法，分別吸取上述6 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲醇（70∶10∶2，V/V/V）為展開劑，展開，揮干溶劑，置365 nm 波長(zhǎng)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，詳見圖1 C。

2.2 檢查

按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》顆粒劑項(xiàng)下規(guī)定，對(duì)3批樣品的粒度、水分、溶化性、干燥失重、重金屬、砷鹽進(jìn)行檢查，結(jié)果3 批樣品的檢查結(jié)果均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。詳見表1。

表1 3批樣品檢査結(jié)果Tab.1 Inspection results of three batches of samples

2.3 石吊蘭素含量測(cè)定（HPLC 法）

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Dikma-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（68∶32，V/V）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：334 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.3.2 溶液制備

取石吊蘭素對(duì)照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加甲醇溶解，制得質(zhì)量濃度為50μg/mL 的石吊蘭素對(duì)照品溶液。取樣品適量，研細(xì)，取細(xì)粉1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50 mL 75%甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放至室溫，精密稱定，加75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，制得供試品溶液。按處方工藝稱取除巖豇豆外的各藥材，制備缺巖豇豆藥材的陰性無糖顆粒劑，并依法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察［8-9］

專屬性試驗(yàn)：分別吸取2.3.2 項(xiàng)下3 種溶液適量，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果石吊蘭素色譜峰與其他組分峰可達(dá)到基線分離，供試品溶液色譜中在與石吊蘭素對(duì)照品溶液色譜相同時(shí)間處出現(xiàn)相應(yīng)色譜峰，陰性對(duì)照無干擾。詳見圖2。

1.石吊蘭素A.對(duì)照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對(duì)照品溶液圖2 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.LysionotinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms of the specific test

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.3.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液1，2，3，4，5 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容。按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以石吊蘭素峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 45.52X+ 14.833，r =0.999 6（n=5）。結(jié)果表明，石吊蘭素質(zhì)量濃度在5～50μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.3.2 項(xiàng)下供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為0.28%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20160701）樣品1 g，精密稱定，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果含量的RSD為0.35%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20160701）樣品，共6 份，按2.3.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果含量的RSD為0.33%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20160701）樣品，研細(xì)，取細(xì)粉1 g，精密稱定，共6 份，加入適量石吊蘭素對(duì)照品溶液，按2.3.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 石吊蘭素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test of lysionotin（n=6）

2.3.4 樣品含量測(cè)定

分別取3 批（批號(hào)分別為20160701，20160702，20160703）樣品各適量，精密稱定，按2.3.2項(xiàng)下方法平行制備2 份供試品溶液，并按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果6份供試品溶液中石吊蘭素的含量分別為31.70，31.29，29.62，30.21，32.17，32.07μg/g，平均含量為31.18 μg/ g，RSD為3.34%（n=6）。將3 批樣品中石吊蘭素含量的平均值下降20%，即樣品中石吊蘭素的含量不得低于24.94μg/g。

2.4 顆粒劑與傳統(tǒng)湯劑的藥效比較［10］

對(duì)小鼠氨水引咳試驗(yàn)的影響：取KM 種小鼠40 只，體質(zhì)量（20 ± 2）g，雌雄各半，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、傳統(tǒng)湯劑組（1 g/mL）、顆粒劑組（0.387 g/mL）、陽性對(duì)照組（復(fù)方巖白菜素2.8 mg/mL），各10只。以0.2 mL/10 g劑量灌胃給藥，每天1 次，連續(xù)7 d，空白對(duì)照組灌胃等量生理鹽水。于末次給藥1 h 后，將小鼠置玻璃鐘罩內(nèi)，用超聲霧化器定量恒壓噴霧氨水至玻璃鐘罩內(nèi)，噴霧10 s，取出小鼠，置另一清潔鐘罩內(nèi)，觀察并記錄小鼠的咳嗽潛伏期和3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)。結(jié)果見表3。

表3 顆粒劑與傳統(tǒng)湯劑的藥效比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of efficacy between granules and traditional decoction（±s，n=10）

表3 顆粒劑與傳統(tǒng)湯劑的藥效比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of efficacy between granules and traditional decoction（±s，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與傳統(tǒng)湯劑組比較，#P ＞0.05；與復(fù)方巖白菜素組比較，△P ＞ 0.05；與阿司匹林組比較，◆P ＞0.05；- 為無數(shù)據(jù)。Note：Compared with those in the blank control group，*P ＜0.05；Compared with those in the traditional decoction group，#P ＞ 0.05；Compared with those in the compound bergenin group，△P ＞ 0.05；Compared with those in the aspirin group；◆P ＞0.05.- refers to no data.

組別空白對(duì)照組復(fù)方巖白菜素組阿司匹林組傳統(tǒng)湯劑組顆粒劑組劑量2.8 mg/mL 10 mg/mL 1 g/mL 0.387 g/mL咳嗽潛伏期（s）64.92±6.72 88.90±13.52*#-81.91±16.42*△82.90±6.31*#△3 min咳嗽次數(shù)20.87±2.53 15.30±4.22*#-15.70±5.59*△15.03±4.34*#△腫脹抑制率（%）152.18±23.7-120.59±16.58*#132.32±13.40*◆129.44±19.22*#◆

對(duì)二甲苯致小鼠耳廊腫脹的影響：分組與給藥方法同小鼠氨水引咳試驗(yàn)項(xiàng)下，陽性對(duì)照組給予阿司匹林10 mg/mL，末次給藥1 h 后，于小鼠右耳兩面均勻涂抹20 μL 二甲苯致炎，40 min 后處死小鼠，用打孔器在小鼠左右耳相同位置打孔，取小鼠左右耳片，稱定質(zhì)量，計(jì)算腫脹抑制率。結(jié)果見表3。

由表3 可知，與空白對(duì)照組比較，顆粒劑組和傳統(tǒng)湯劑組均可顯著延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期，降低小鼠3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)和小鼠耳腫脹抑制率（P ＜0.05），表明該方藥效良好；與傳統(tǒng)湯劑組比較，顆粒劑組藥效更強(qiáng)，但無顯著差異（P ＞0.05）。結(jié)果表明，二巖虎果湯改變?cè)瓌┬椭瞥深w粒劑的方案科學(xué)、合理、可行。

3 討論

中藥制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究能有效考察制劑的內(nèi)在質(zhì)量，是評(píng)價(jià)藥品安全性的重要依據(jù)［11］，同時(shí)也反映了中藥制劑指標(biāo)性成分和毒性成分的含量，進(jìn)而衡量原料藥和制劑工藝的質(zhì)量，對(duì)于保證中藥制劑質(zhì)量具有重要意義。

TLC 鑒別時(shí)，參考了2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》方法，并結(jié)合實(shí)際對(duì)展開劑比例、展開時(shí)間等因素作了適當(dāng)調(diào)整與優(yōu)化。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，巖豇豆以三氯甲烷-甲醇-甲酸為展開劑時(shí)，雖然分離效果較好，但比移值較高，斑點(diǎn)不清晰，故將展開劑中的三氯甲烷-甲醇換成極性較小的甲苯-乙酸乙酯，而以甲苯-乙酸乙酯-甲酸為（5∶2∶1，V/V/V）展開劑時(shí)，對(duì)石吊蘭素的分離效果較好，斑點(diǎn)較清晰，且陰性對(duì)照無干擾，故選擇甲苯-乙酸乙酯-甲酸作為二巖虎果無糖顆粒中巖豇豆的展開劑。由于巖白菜藥材中含有巖白菜素、熊果苷等成分，且?guī)r白菜素理化性質(zhì)不穩(wěn)定，故在對(duì)巖白菜素進(jìn)行TLC 鑒別時(shí)考察了三氯甲烷- 乙酸乙酯- 甲醇、石油醚- 乙酸乙酯- 甲醇- 36%乙酸、三氯甲烷- 甲醇等多個(gè)展開劑系統(tǒng)，最終確定展開劑為三氯甲烷- 甲醇（4∶1，V/V）。以藥典規(guī)定的石油醚- 甲酸乙酯- 甲酸為展開劑對(duì)二巖虎果無糖顆粒中虎杖進(jìn)行TLC 鑒別，結(jié)果大黃素的分離效果較差，可能與二巖虎果無糖顆粒由多味藥材組方有關(guān)。本研究中對(duì)展開劑進(jìn)行調(diào)整與優(yōu)化，最終以苯-乙酸乙酯-甲醇（70∶10∶2，V/V/V）為展開劑，結(jié)果大黃素的分離效果較好，斑點(diǎn)清晰，比移值適中，且陰性對(duì)照無干擾，故選其作為展開劑。

中藥顆粒劑受劑型因素影響，易于吸潮，在儲(chǔ)存期間易變質(zhì)，為保證藥品的質(zhì)量需控制水分［12］；顆粒劑的粒度與藥物的溶出度、溶化性及灌裝的均勻性有關(guān)；重金屬、砷鹽等與顆粒劑的安全性有關(guān)［13-14］。故對(duì)二巖虎果無糖顆粒進(jìn)行了上述項(xiàng)目的檢查，結(jié)果二巖虎果無糖顆粒檢查項(xiàng)均符合藥典規(guī)定，表明二巖虎果無糖顆粒的制備工藝合理、可行。

石吊蘭素是君藥巖豇豆的主要活性成分［15-16］，水溶性較強(qiáng)，可很好地轉(zhuǎn)移到制劑中，故選擇其作為二巖虎果無糖顆粒定量測(cè)定的指標(biāo)性成分。本研究中測(cè)定二巖虎果無糖顆粒自制樣品中石吊蘭素的含量，測(cè)得各批樣品分別含石吊蘭素31.50，29.92，32.12 μg/ g，另根據(jù)測(cè)得的3批樣品中石吊蘭素的平均含量，建議二巖虎果無糖顆粒每袋含巖豇豆以石吊蘭素（C18H16O7）計(jì)不得少于0.374 1 mg。

二巖虎果湯的傳統(tǒng)劑型為水煎劑，在顆粒劑的制備過程中課題組采用了水提醇沉工藝，為驗(yàn)證改變劑型后的顆粒劑的療效不受影響，本研究中采用經(jīng)典止咳、抗炎藥效動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)比較了顆粒劑與傳統(tǒng)湯劑的藥效，結(jié)果顆粒劑的作用較傳統(tǒng)湯劑強(qiáng)，說明在改變劑型的過程中，藥效未改變，所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)合理、可行。