高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定麻黃-桂枝藥對(duì)中7 種成分含量

王東海，湯建華，楊曉媛，于小緯

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075000）

麻黃- 桂枝藥對(duì)在麻黃湯、大青龍湯等經(jīng)典方劑中都有應(yīng)用，是中醫(yī)臨床常用藥對(duì)。麻黃主要有效成分為鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、鹽酸甲基麻黃堿等［1］，具有鎮(zhèn)咳平喘、發(fā)汗等作用［2］。桂枝主要有效成分為桂皮醛、桂皮醇、桂皮酸、香豆素等［3］，具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等作用［4］。麻黃湯中麻黃與桂枝的配伍比例為3∶2，即麻黃用量150 g，桂枝用量100 g，為治療外感風(fēng)寒表實(shí)證的名方。麻黃發(fā)表散寒，配伍辛溫之桂枝，解肌祛風(fēng)，兩藥相須為用，增強(qiáng)發(fā)汗、解表、散寒之功效［5］。本研究中按麻黃和桂枝配伍比例3∶2 制備藥對(duì)，參考文獻(xiàn)［6-10］，建立了同時(shí)測(cè)定麻黃-桂枝藥對(duì)提取物中麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿、桂皮酸、桂皮醇、桂皮醛和香豆素7種成分含量的高效液相色譜切換波長(zhǎng)法，以評(píng)價(jià)麻黃-桂枝藥對(duì)提取物的質(zhì)量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司），配有2998 型二極管陣列檢測(cè)器和2695 Alliance 型四元梯度泵；MSE 6.6S - 0CE - DM 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司，精度為0.001 mg）；AUW120D 220D 型電子分析天平（日本島津公司，精度為0.01 mg）；D115 型烘箱（德國(guó)Binder 公司）；KQ -500B 型超聲波清洗儀（鄭州寶晶電子科技有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；XJA - 1A 型萬(wàn)能粉碎機(jī)（江蘇姜堰市銀河實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.2 試藥

鹽酸麻黃堿對(duì)照品（批號(hào)為171241 - 201809），鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品（批號(hào)為171237 - 201510），鹽酸甲基麻黃堿對(duì)照品（批號(hào)為171247 - 201502），桂皮酸對(duì)照品（批號(hào)為110786-201604），桂皮醛對(duì)照品（批號(hào)為110710 - 201821），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均大于98.0%；香豆素對(duì)照品（江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，CAS 號(hào)為91 - 64 - 5，純度大于98%）；桂皮醇對(duì)照品（南京森貝伽生物科技有限公司，CAS 號(hào)為104 - 54 - 1，純度大于98%）；麻黃飲片和桂枝飲片均為市售（藥材信息見表1），經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為麻黃科植物草麻黃Ephedra sinicaStapf.的干燥草質(zhì)莖、肉桂Cinnamomum cassiaPresl.的干燥嫩枝，符合2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》規(guī)定。甲醇、乙腈（色譜純，天津賽孚瑞科技有限公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

表1 麻黃-桂枝藥對(duì)藥材信息Tab.1 Sources information of Ephedrae Herba-Cinnamomi Ramulus herb pairs

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）- 含0.1%NH4Cl 的0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min 時(shí)10%A，10～20 min 時(shí)10%A→20%A，20～30 min 時(shí)20%A→35%A，30～45 min 時(shí)35%A→50%A，45～50 min 時(shí)10%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～20 min 時(shí)210 nm（鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和鹽酸甲基麻黃堿），21～50 min 時(shí)250 nm（香豆素、桂皮醇、桂皮酸和桂皮醛）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：取鹽酸甲基麻黃堿對(duì)照品28.65 mg、香豆素對(duì)照品10.30 mg、桂皮醇對(duì)照品17.72 mg、桂皮酸對(duì)照品7.468 mg、桂皮醛對(duì)照品70.32 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加甲醇超聲處理，并稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品貯備液Ⅰ。取鹽酸麻黃堿對(duì)照品56.75 mg、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品22.56 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，精密加入混合對(duì)照品貯備液Ⅰ5 mL，加甲醇超聲處理，溶解后稀釋至刻度，配制成每1 mL含鹽酸麻黃堿1 135.00 μg、鹽酸偽麻黃堿451.20 μg、鹽酸甲基麻黃堿114.60 μg、香豆素41.21 μg、桂皮醇70.89μg、桂皮酸29.87μg 和桂皮醛281.30μg 的混合對(duì)照品貯備液Ⅱ。精密量取5 mL混合對(duì)照品貯備Ⅱ液，置25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取麻黃、桂枝飲片適量，粉碎，粉末混勻，過50 目篩，分別稱取3.0 g 和2.0 g，精密稱定，置250 mL錐形瓶中，加甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，浸泡50 min，50 ℃超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）提取60 min，放冷，損失的質(zhì)量用甲醇補(bǔ)足，過濾，取續(xù)濾液，于5 ℃、10 000 r/min轉(zhuǎn)速下高速離心10 min，取上清液，即得。

麻黃、桂枝對(duì)照藥材溶液：取上述麻黃、桂枝飲片粉末0.3 g、0.2 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備溶液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：分別精密吸取2.2 項(xiàng)下3 種溶液各10μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，7種待測(cè)成分與相鄰峰間的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按鹽酸麻黃堿峰、鹽酸偽麻黃堿峰、鹽酸甲基麻黃堿峰、香豆素峰、桂皮醇峰、桂皮酸峰和桂皮醛峰均大于6 000，拖尾因子均小于1.35。麻黃對(duì)照藥材溶液色譜圖中，在無(wú)與桂皮醇、桂皮酸、桂皮醛和香豆素對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有相應(yīng)峰，桂枝對(duì)照品溶液色譜中無(wú)與麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿相應(yīng)的峰，表明麻黃與桂枝配伍后，對(duì)彼此的成分測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液0.8，2.0，3.0，5.0，7.0，10.0 mL，置20 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別精密量取10μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以各成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

表2 7種指標(biāo)性成分線性關(guān)系考察結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the linear relation test of seven components（n=6）

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次。結(jié)果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、鹽酸甲基麻黃堿、香豆素、桂皮醇、桂皮酸和桂皮醛峰面積的RSD分別為0.67%，0.75%，1.15%，1.34%，1.26%，0.99%，1.48%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1）粉末適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0，5，10，15，20，35，48 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、鹽酸甲基麻黃堿、香豆素、桂皮醇、桂皮酸和桂皮醛峰面積的RSD分別為0.43%，0.65%，1.02%，1.32%，0.89%，0.76%，1.54%（n= 7），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.鹽酸麻黃堿 2.鹽酸偽麻黃堿 3.鹽酸甲基麻黃堿 4.香豆素 5.桂皮醇 6.桂皮酸 7.桂皮醛A.混合對(duì)照品溶液 B.供試品溶液 C.桂枝對(duì)照藥材溶液 D.麻黃對(duì)照藥材溶液圖1 高效液相色譜圖1.Ephedrine hydrochloride 2.Pseudoephedrine hydrochlorid 3.Methylephedrine hydrochloride 4.Coumarin 5.Cinnamic alcohol 6.Cinnamic acid 7.CinnamaldehydeA.Mixed reference solution B.Test solution C.Reference medicinal material solution of Cinnamomi Ramulus D.Reference medicinal material solution of Ephedrae HerbaFig.1 HPLC chromatograms

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1）粉末6 份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、鹽酸甲基麻黃堿、香豆素、桂皮醇、桂皮酸和桂皮醛的平均含量分別為3.021，1.205，0.303，0.165，0.291，1.123，0.126 mg/g，RSD分別為0.35%，0.42%，0.98%，1.31%，1.12%，0.61%，1.25%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1）粉末適量，麻黃飲片粉末1.5 g，桂枝飲片粉末1.0 g，精密稱定，共6份，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液4 mL，依法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見表3。

表3 7種指標(biāo)性成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test of seven components（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

精密量取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、麻黃對(duì)照藥材溶液、桂枝對(duì)照藥材溶液各10μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定4 批樣品（編號(hào)為S1-S4）中7 種成分的含量，結(jié)果見表4。采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)4 批麻黃- 桂枝藥對(duì)中各成分的含量和其對(duì)應(yīng)單藥材中各成分的含量進(jìn)行t檢驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)麻黃-桂枝配伍后，除桂皮酸外，其余6 種成分含量均顯著減少（P＜0.05）。

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

曾考察乙腈- 0.05%磷酸水溶液、乙腈- 0.05%甲酸水溶液、乙腈-0.2%三乙胺水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液（含0.1%NH4Cl）。結(jié)果以乙腈- 0.05%甲酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，由于帶正電荷的堿性化合物麻黃堿與帶負(fù)電荷的色譜柱表面硅羥基間的離子交換會(huì)引起峰拖尾［11］，導(dǎo)致麻黃堿和偽麻黃堿分離度不符合要求，無(wú)法保證含量準(zhǔn)確度；以乙腈-0.2%三乙胺水溶液為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰峰形有所改善，但各成分保留時(shí)間不穩(wěn)定；以乙腈-0.05%磷酸水溶液（含0.1%NH4Cl）為流動(dòng)相時(shí)，基線較平穩(wěn)，7 種成分色譜峰與相鄰雜質(zhì)峰分離完全，對(duì)稱因子在1.10～1.35 間，符合系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)的規(guī)定。故選擇乙腈-含0.1%NH4Cl的0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相。

3.2 提取條件選擇

曾考察樣品提取方法（超聲、加熱回流）、提取溶劑（甲醇、乙醇、丙酮）、浸泡時(shí)間（40，50，60 min）、提取時(shí)間（40，60，90 min）、溶劑用量（25，50，100 mL）。結(jié)果加熱回流與超聲兩種方式的提取率相當(dāng)，但加熱回流操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，需要的樣品初始濃度較大；以乙醇和丙酮作為提取溶劑時(shí)，桂皮醛和麻黃堿的提取率較低，以甲醇作為提取溶劑時(shí)，7 種成分的提取率最高，含量測(cè)定結(jié)果的RSD均小于1.5%；浸泡時(shí)間和提取時(shí)間分別為50 min 和60 min 時(shí)，浸泡和提取較充分；提取溶劑量為50 mL 時(shí)。7 種成分響應(yīng)值適中。故確定甲醇作溶劑、浸泡50 min、超聲處理60 min、提取溶劑量為50 mL為麻黃-桂枝藥對(duì)的最佳提取條件。

3.3 麻黃-桂枝配伍化學(xué)含量與藥效分析

由表4可知，麻黃-桂枝配伍后，除桂皮酸外，麻黃和桂枝中7種成分的溶出較單味藥材均顯著減少（P＜0.05），與徐文杰等［12］麻黃- 桂枝不同比例配伍前后水煎液中有效成分的含量較單味藥材均減少的研究一致。徐文杰等［13］的研究表明，麻黃-桂枝配伍后，麻黃中麻黃類生物堿的溶出減少，使配伍表現(xiàn)出減毒作用。鄭芳昊［14］的研究發(fā)現(xiàn)，麻黃-桂枝藥對(duì)配伍后，可使試驗(yàn)動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能從興奮趨于正常。方芳［15］指出，麻黃- 桂枝配伍后解熱作用增強(qiáng)，說(shuō)明麻黃- 桂枝藥對(duì)配伍后利于解熱，其中麻黃- 桂枝藥對(duì)的配伍比例為3∶2 時(shí)的解熱作用最佳。由此可知，麻黃類生物堿是麻黃的效、毒兩性成分，麻黃與桂枝相須為用，配伍后麻黃的毒性減弱。但麻黃- 桂枝不同比例配伍后各有效成分的含量及藥之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.4 Results of content determination of seven components in the samples（mg/g，n=3）