D6非優質凍融囊胚移植策略的探討

彭姝明，劉海鵬，李蘇萍，楊帆，段麗

(郴州市第一人民醫院生殖醫學中心，郴州 423000)

眾所周知，凍融囊胚移植的臨床妊娠率顯著優于常規的凍融卵裂胚移植[1-3]。目前，大多數生殖中心通常會建議患者先凍存2枚或更多的優質第3天(D3)卵裂胚，然后將剩余的D3可利用卵裂胚行囊胚培養以獲得囊胚用于移植或者凍存。選擇性單個優質囊胚移植是目前推薦的最佳凍融囊胚移植策略。然而，對于非優質囊胚，尤其是第6天(D6)非優質囊胚的移植策略依然并不明確。研究發現，D6凍融囊胚移植的臨床妊娠率顯著低于第5天(D5)凍融囊胚移植[4-5]。廣大輔助生殖技術(ART)工作者對于D5凍融囊胚移植和D6優質凍融囊胚移植所獲取的臨床結局是滿意的，然而，對D6非優質凍融囊胚移植的臨床妊娠結局卻不是很滿意。對于有D3優質卵裂胚凍存而只能獲取D6非優質囊胚的患者或者只剩余D6非優質囊胚和D3優質卵裂胚的患者群體而言，如何盡可能的為患者爭取最佳的臨床結局？在此情形下制訂最佳的胚胎移植策略是亟需解決的問題。為了研究D6非優質凍融囊胚的移植策略是否完善，本研究回顧性分析了2016年9月至2020年7月于我中心行不同凍融胚胎移植方案的臨床結局，試圖為完善和優化D6非優質凍融囊胚的移植策略提供新的思路。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2016年9月至2020年7月于我中心行凍融胚胎移植患者的臨床資料。

納入標準：(1)年齡≤42歲；(2)基礎FSH<12 U/L；(3)18.5 kg/m2<體質量指數(BMI)<24 kg/m2。排除標準：可能影響患者正常妊娠的疾病，如先天遺傳異常、生殖道畸形、反復流產史等。

共納入803個周期。鑒于年齡是影響ART患者妊娠結局的獨立因子，根據患者年齡分為年齡<36歲組(n=429)和年齡≥36歲組(n=374)；各年齡段患者再根據不同的胚胎移植策略分為3組：移植D3優質凍融雙卵裂胚的為A組，移植D6非優質凍融單囊胚的為B組，移植D6非優質凍融雙囊胚的為C組。

二、研究方法

1.子宮內膜準備方案：(1)激素替代周期，適用于月經周期不規律的患者。遞增法口服戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳，德國)，月經第2～4天開始口服4 mg/d，每4 d遞增8 mg；12 d后監測內膜厚度、血清雌二醇(E2)、孕酮(P)水平，酌情調整補佳樂劑量；當子宮內膜厚度≥7 mm、血清E2≥735 pmol/L、P<3.14 nmol/L時，肌肉注射黃體酮(浙江仙琚)60 mg，1次/d，至胚胎移植日。把開始黃體轉換日定為起始日，卵裂胚移植于黃體酮注射的第5天行D3卵裂胎移植，囊胚移植于第6天行D6囊胚移植。(2)自然周期，適用于月經規律患者。凍融囊胚患者從月經第11天開始行陰道B超監測排卵，排卵日定為起始日，于起始日開始肌肉注射黃體酮40 mg，1次/d，至胚胎移植日，在排卵后第5天行D6囊胚移植。凍融卵裂胚移植患者從月經的第10天開始監測卵泡的發育及子宮內膜情況，當卵泡>15 mm時，監測血清LH、E2及P水平判斷具體排卵日期，當子宮內膜≥8 mm定為起始日，肌肉注射黃體酮40 mg/d行黃體支持，注射的第4天行D3凍融卵裂期胚胎移植。

2.凍融胚胎的解凍及培養：(1)D3凍存卵裂胚的解凍及培養：移植前一天下午進行卵裂胚的解凍，采用玻璃化復蘇試劑盒(Vitrification VT102，KITAZATO，日本)，將載桿在液氮中取掉套管后拿出，迅速置于解凍液(TS)中室溫放置1 min，然后移入稀釋液(DS)中3 min，洗滌液1(WS1)中5 min，洗滌液2(WS2)中5 min。卵裂胚復蘇后采用序貫系列培養液(Vitrolife-G5，Vitrolife，瑞典)繼續培養。卵裂胚解凍后轉入囊胚培養液(G2)并觀察評分后，置三氣培養箱(Forma 3131，美國)內于37℃、6% CO2、5% O2條件下培養，繼續培養至第2天上午激光輔助孵化后行胚胎移植。(2)凍存囊胚的解凍及培養。于移植日上午解凍囊胚，解凍培養步驟同上。將解凍的囊胚轉入囊胚培養液(G2)，進行胚胎觀察后置三氣培養箱內培養2 h后移植。

3.胚胎評價標準：卵母細胞正常受精后第3天觀察胚胎形態，根據胚胎卵裂球的數目、均一度和碎片比例評估胚胎。我中心將D3卵裂球為7～9個、無大小不均或輕度不均且碎片<20%的卵裂期胚胎定義為D3優質卵裂期胚胎。卵裂胚復蘇后卵裂球存活率≥50%即視為復蘇存活卵裂胚。受精5～6天后觀察囊胚形態，按照經典的Gardner囊胚評分標準[6]，根據囊胚腔的大小、內細胞團細胞的數量及形態、滋養層細胞的數量及形態等3個方面對囊胚進行評級。本中心將囊胚腔擴張程度為4～6期、內細胞團或滋養層評分至少包含1個C級囊胚定義為D6非優質囊胚。

4.妊娠結局的判斷：卵裂胚移植后14 d或者囊胚移植后11 d測血清HCG，血清HCG>5 U/L定義為HCG陽性；胚胎移植后4周，經超聲檢查見孕囊或見胎心搏動則判定為臨床妊娠。

5.觀察指標：觀察各組患者的一般資料和胚胎復蘇率、臨床妊娠率、胚胎種植率、流產率、多胎妊娠率和活產率。胚胎復蘇率=復蘇存活胚胎數/解凍胚胎數×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%，胚胎種植率=孕囊數/移植胚胎數×100%，流產率=流產周期數/臨床妊娠周期數×100%，多胎妊娠率=超過1個孕囊的妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%，活產率=分娩胎兒的周期數/移植周期數×100%。

三、統計學分析

結 果

一、一般情況比較

本研究共納入803個周期，其中年齡<36歲組429周期，年齡≥36歲組374周期。同年齡段中各組間平均年齡、基礎FSH、移植日內膜厚度和BMI比較均無顯著差異(P>0.05)；而A組人工周期占比顯著低于B組和C組，自然周期占比顯著高于B組和C組(P<0.05)(表1)。

表1 不同年齡患者各組一般資料比較[(-±s)，n(%)]

二、不同年齡段各組間胚胎復蘇情況和臨床妊娠結局比較

在<36歲年齡段中，各組間胚胎復蘇率、臨床妊娠率、流產率和活產率比較均無顯著差異(P>0.05)，而B組和C組胚胎種植率均顯著高于A組(P<0.05)，B組的多胎妊娠率顯著低于A組和C組(P<0.05)(表2)。

表2 <36歲患者各組間復蘇情況及臨床結局比較(%)

在≥36歲年齡段中，各組間胚胎復蘇率比較均無顯著差異(P>0.05)，A組和C組的臨床妊娠率、活產率均顯著高于B組(P<0.05)，A組和C組的胚胎種植率顯著低于B組(P<0.05)，C組的多胎妊娠率顯著高于A組和B組(P<0.05)(表3)。

表3 ≥36歲患者各組間復蘇情況及臨床結局比較(%)

討 論

在ART日漸成熟的今天，獲取臨床妊娠的效率依舊不能令人滿意，囊胚移植是提升ART效率的有力手段之一。但直至今日依然沒有任何可靠的預測因子來預估囊胚的形成[7-9]，這也是困擾ART工作者的一大難題。目前，由于缺乏可靠的預測指標，在臨床工作中通常是選擇凍存數枚優質D3卵裂胚，剩余的可利用卵裂胚則用來培養囊胚；或者先移植卵裂胚，剩余的卵裂胚或冷凍或用來培養囊胚。然而，囊胚培養的成功率卻并不令人滿意。研究表明，有2%～40%的患者可能因為無囊胚形成而被迫取消囊胚移植[10-11]。當獲得可利用囊胚后，制訂最佳的囊胚移植策略是重中之重。目前，主流的囊胚移植策略是選擇性單囊胚移植，以其滿意的臨床妊娠率和較低的多胎妊娠率為廣大ART工作者所接受[12-13]。但必須指出的是，選擇性單囊胚移植事實上指的是單個優質囊胚移植的胚胎移植策略，那么未能獲取優質囊胚患者的囊胚移植策略該如何制訂？以往的研究證明，單個D5或D6優質囊胚移植的臨床結局都令人滿意，且D5非優質單囊胚的臨床結局也非常不錯，而D6非優質單囊胚移植的臨床結局相對而言就不是很理想[14-16]。我們曾經嘗試通過增加D6非優質囊胚移植數目(例如雙囊胚移植)來提升臨床妊娠率和活產率，但隨之也帶來了多胎妊娠問題。在只有D6非優質可利用囊胚的情況下如何制訂最佳的囊胚移植策略以獲取最佳的臨床結局，這是困擾我們的一大難題。

本研究結果證實，當患者年齡<36歲時，D6非優單囊胚移植、D6非優雙囊胚移植和D3優質雙卵裂胚移植3種胚胎移植策略所獲得的臨床妊娠率比較無顯著差異(P>0.05)，D6非優單囊胚移植組和D6非優雙囊胚移植的胚胎種植率均顯著高于D3優質雙卵裂胚移植組(P<0.05)，各組間活產率比較無顯著性差異(P>0.05)，但D6非優單囊胚移植組的多胎妊娠率顯著低于其他兩組(P<0.05)。以上結果表明，對于年齡<36歲的患者而言凍融D6非優單囊胚移植仍然是最佳的凍融胚胎移植策略。當患者年齡≥36歲時，3種凍融胚胎移植策略的數據則發生了變化。D6非優單囊胚移植組的臨床妊娠率、活產率均顯著低于其他兩組(P<0.05)；D3優質雙卵裂胚移植組多胎妊娠率與D6非優單囊胚移植組比較無顯著差異(P>0.05)，而D6非優雙囊胚移植組的多胎妊娠率(45.90%)則仍然維持在非常高的水平，顯著高于其他兩組(P<0.05)。以上結果表明，當患者年齡≥36歲時，D6非優單囊胚移植已經不能夠提供最好的臨床結局。雖然可以通過雙囊胚移植的策略來提升臨床妊娠率和活產率，但是居高不下的多胎妊娠率使得該移植策略的可行性受阻。多胎妊娠實際上是ART的一種并發癥，而且多胎妊娠對于患者的臨床結局有著諸多不利影響。尤其對于高齡患者(年齡≥36歲)而言，獲取臨床妊娠的幾率本就相對較低，多胎妊娠對于高齡患者的危害也是不言而喻的。本研究發現，對于高齡患者(年齡≥36歲)D6凍融非優雙囊胚的移植策略并不值得推薦，而D3凍融優質雙卵裂胚移植策略是可行的胚胎移植策略，即在保證了令人滿意臨床妊娠率和活產率的前提條件下，又將多胎妊娠率降到了一個可以接受的水平(10%左右)，這無疑是高齡患者可以接受的凍融胚胎移植策略。

眾所周知，D3優質卵裂胚行囊胚培養的可利用囊胚形成率是非?？捎^的[9]。以我中心的囊胚培養數據為例，D3優質卵裂胚行囊胚培養的可利用囊胚形成率在65%～70%，其中獲取優質囊胚的幾率在40%左右，獲取D5可利用囊胚的幾率在45%左右。以上結果說明，移植2枚D3優質卵裂胚通常情況下有相當大的幾率形成至少1枚可利用囊胚。這可能是D3凍融優質雙卵裂胚移植的臨床妊娠率和活產率不低于D6凍融非優囊胚移植的合理解釋。此外，年齡也是一個影響囊胚形成的關鍵因素。對于年齡≥36歲的高齡患者而言，囊胚培養獲得可利用囊胚的幾率也在逐漸下降，這可能是年齡≥36歲的高齡患者凍融D3優質雙卵裂胚移植多胎妊娠率顯著低于D6非優質雙囊胚移植的原因。

本研究尚存在不足之處，如本研究為單中心的回顧性分析，缺乏大樣本前瞻性研究數據佐證。另外，本研究納入的患者大多數年齡≤40歲，納入年齡>40歲的高齡患者較少，對于高齡患者的移植策略還有待于擴大樣本進一步深入研究。

綜上所述，本中心總結推薦對于只有D3優質雙卵裂胚和D6非優質囊胚凍存的患者，當患者年齡<36歲時，可采用D6凍融非優單囊胚移植方案；當患者年齡≥36歲時，可選D3凍融優質雙卵裂胚移植方案。