OHSS模型大鼠卵巢組織中自噬、凋亡和氧化應激相關蛋白的表達及意義

張光云，黃旋，陳莉，姚兵*

(1. 南京師范大學生命科學學院，南京 210023；2. 中國人民解放軍東部戰區總醫院生殖醫學中心，南京 210002)

卵巢過度刺激綜合征(OHSS)是輔助生殖治療過程中控制性促排卵時常見的一種醫源性并發癥，以卵巢增大、血清高激素水平、血管通透性增加、第三體腔積液及相關的病理生理過程為主要特征。輕度OHSS的發生率約占1/3，中重度的發生率為3.1%～8%[1]，其發病機制主要與人絨毛膜促性腺激素(HCG)作用下血管活性因子增多導致的血管內皮屏障破壞相關[2-4]。

有研究報道，自噬、氧化應激與卵巢功能密切相關[5-8]。自噬是細胞在應激條件下防止損傷并促進細胞存活；多種環境和化學刺激等導致活性氧大量產生，氧化應激可以激活自噬，自噬通過負反饋作用保護細胞。氧化應激、自噬同時對細胞凋亡有調節作用。

研究采用孕馬血清促性腺激素(PMSG)聯合HCG建立OHSS模型[9]。前期研究發現，OHSS超生理水平的激素釋放與卵巢顆粒細胞增殖相關[10]。另外文獻報道稱糾正卵巢氧化應激可以預防和治療OHSS[11]。但是，氧化應激、自噬、凋亡在OHSS發生發展中的具體作用尚未見報道。本實驗旨在觀察OHSS模型中氧化應激、自噬及細胞凋亡的作用并探討其可能調節機制。

材料與方法

一、研究對象

1.實驗動物：22日齡雌性Sprague-Dawley清潔級大鼠20只(東部戰區總醫院實驗動物中心)，體重(60±10)g。飼養于18℃～25℃、相對濕度 40%～60%、晝夜比為12 h∶12 h 的環境中，自由攝食飲水。本研究涉及的實驗大鼠研究包括大鼠的樣本收集等過程均得到東部戰區總醫院倫理學會的批準和指導(倫理批號：20140729)，所有操作過程符合AAALAC和IACUC指南規定。

2.主要試劑：PMSG及HCG(寧波第二激素廠)，大鼠血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、睪酮(T)水平檢測采用全自動化學發光免疫分析法(Backman Coulter，Inc.，Brea CA，USA)，大鼠FSH(CK-E30623R)、LH(CK-E30597R)、活性氧(ROS)(SEB971Hu)、超氧化物歧化酶(SOD)(SES134Hu)ELISA試劑盒(Cloud-Clone，USA)，一抗兔源LC3(#12741)、Atg3(#3415)、Beclin-1(#3495)、Nrf2(#12721)、Cleaved Caspase-3(#9664)、P-ERK1/2(#4695)及ERK1/2抗體(#4370)(CST，USA)，一抗Bax(ab69643)、Bcl-2(ab194583)及p53(ab1431)(Abcam，UK)，一抗p62(sc-48389)(SANTA，USA)，β-actin抗體(CST，USA)。

二、研究方法

1.動物分組：大鼠隨機分為對照組、模型組，每組10只，以大鼠日齡為實驗記錄時間。對照組(CTL組)：第22～23天每天注射等體積(0.3 ml)0.9%生理鹽水，第24天注射PMSG 10 U(10 U/0.3 ml)，第26天注射 HCG 10 U(10 U/0.3 ml)；模型組(卵巢過度刺激綜合征組，OHSS組)：第22～25天每天連續腹腔注射PMSG 50 U(50 U/0.3 ml)，在第26 天注射HCG 150 U(150 U/0.3 ml)。實驗結束后處死大鼠，眼眶取血，2 000 轉/min離心10 min，收集血清，分離卵巢組織，右側-80℃凍存備用，左側固定于4%多聚甲醛備用。

2.卵巢組織學檢查：卵巢組織4%多聚甲醛固定24 h后，經過梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟等處理后進行石蠟包埋備用。5 μm厚度連續切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色后光鏡觀察。各級卵泡計數：對整個卵巢組織進行連續切片，于最大切面為待檢平面，前后每隔5張取一張固定于載玻片中(共10張)，進行卵泡計數。HE染色后，對卵巢切片中初級卵泡(PF)、竇狀卵泡(AF)、排卵前卵泡(POF)、閉鎖卵泡(Atret.F)、黃體(CL)等各級卵泡分別進行計數，為防重復計數，計數時只計核著色的卵泡，并進行統計分析。

3.血清生殖激素水平檢測：由東部戰區總醫院中心實驗科檢測血清E2、P、T水平，E2、P、T的檢出限分別為65.8～714.4 pmol/L、0.6～3.8 nmol/L和0.34～2.55 nmol/L，批內和批間系數變量分別為5.13%和6.23%，8.18%和7.89%，以及2.71%和5.65%。采用ELISA試劑盒檢測血清FSH、LH水平。

4.免疫組織化學染色：將卵巢組織切片，60℃烤片后經過程序性酒精脫蠟、水化，檸檬酸鈉緩沖液中進行抗原修復(高火1 min，中火2 min，低火7 min)，利用3% H2O2失活內源過氧化氫酶，打孔液(PBS∶Tween 20∶Triton 100=1 000∶10∶5)室溫處理15 min，正常型山羊血清(AR900)濕盒內室溫封閉1 h，1% BSA配制兔源LC3抗體(1∶200)濕盒中4℃過夜，沖洗后室溫孵育二抗(1∶200)1 h，加DAB工作液顯色、蘇木素復染核1 min，再次清洗、分化，乙醇脫水。顯微鏡下對切片進行觀察拍照。

5.卵巢組織ROS、SOD含量測定：按照試劑盒操作說明，進行ROS濃度及SOD酶活性檢測，檢測范圍分別為62.5～4 000 pg/ml、0.156～10 ng/ml；最低檢測濃度分別為27.7 pg/ml、0.055 ng/ml；批內與批間變異系數分別小于10%和15%。

6.Western blot檢測卵巢組織相關蛋白的表達：采用RIPA蛋白裂解液裂解卵巢組織并提取總蛋白，BCA法對蛋白濃度進行定量，加入上樣緩沖液后煮沸10 min。而后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕轉法將蛋白轉印至PVDF膜上，5%BSA室溫封閉1 h，加入5%BSA稀釋(一抗1∶1 000稀釋)過的Atg3、Beclin-1、LC3、p62、Nrf2、Bax、Bcl-2、p53、Cleaved Caspase-3、P-ERK1/2、ERK1/2及β-actin抗體于4℃孵育過夜，TBST清洗三遍后加入二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜三次后采用ECL發光液，于Tanon-5200成像系統掃描進行成像，保存掃描圖像進行分析。

三、統計學分析

結 果

一、卵巢過度刺激對大鼠生長曲線及卵巢大體形態的影響

比較CTL組和OHSS組大鼠體重變化，結果顯示兩組大鼠體重無顯著差異(P>0.05)(圖1 A)；與CTL組相比，OHSS組卵巢體積及重量顯著增加[(0.341 9±0.081 4)g vs.(0.064 3±0.015 0)g，P<0.001)]，OHSS組卵巢組織中可見較多血體(圖1B)；另外，OHSS組卵巢器質比(卵巢重量/體重，g/g×100%)顯著增加[(0.313 1±0.085 6)vs.(0.056 7±0.015 1)，P<0.001](圖1C)。

A：生長曲線；B：卵巢重量及大體形態；C：卵巢器質比。與CTL組比較，*P<0.001。

二、卵巢過度刺激對卵巢結構和血清生殖激素水平的影響

1.卵巢過度刺激對卵巢結構的影響：HE染色結果顯示，OHSS組大鼠卵巢中黃體數目顯著增多(圖2A)。各級卵泡計數結果顯示，OHSS組總卵泡數目較CTL組顯著增加[(60.87±4.36)個vs.(52.07±4.96)個，P<0.05]，其中初級卵泡(PF)、竇狀卵泡(AF)、排卵前卵泡(POF)、閉鎖卵泡(Atret.F)數目均顯著減少，黃體數目則顯著增加[(51.47±3.05)個vs.(8.87±4.78)個，P<0.001)](圖2)。

A：卵巢組織HE染色；B：卵泡總數目；C：各級卵泡數目。PF：初級卵泡；AF：竇狀卵泡；POF：排卵前卵泡；Atret.F：閉鎖卵泡；CL：黃體。圖中箭頭所示為黃體。與CTL組比較，#P<0.05，*P<0.001。

2.卵巢過度刺激對大鼠血清生殖激素的影響：OHSS組大鼠血清中FSH、LH水平較對照CTL組顯著增加(P<0.05)，E2、P、T水平也顯著增加(P<0.001)(圖3)。

與CTL組比較，#P<0.05，*P<0.001。

三、卵巢過度刺激對卵巢自噬的影響

LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值變化反映自噬的程度，Beclin-1和Atg3是自噬的標志蛋白。蛋白免疫印跡及灰度值分析結果顯示：與對照CTL組相比，OHSS組大鼠卵巢組織中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值顯著增加(P<0.05)，自噬相關蛋白Beclin-1和Atg3的表達水平也較對照組顯著增高(P<0.05)；凋亡相關通路pERK1/2蛋白表達水平顯著上調(P<0.001)(圖4A～C)。免疫組化結果表明，在OHSS大鼠卵巢組織中LC3主要分布于黃體組織，且表達水平顯著高于對照CTL組(圖4D)。

A：兩組大鼠卵巢組織自噬相關蛋白(Atg3、Beclin-1、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ)的Western blot圖；B：凋亡相關通路蛋白pERK1/2、ERK1/2的Western blot圖；C：蛋白條帶灰度值分析圖；D：卵巢組織LC3的免疫組織化學染色結果。與CTL組比較，#P<0.05，*P<0.001。

四、卵巢過度刺激對卵巢氧化應激及凋亡的影響

1.兩組大鼠卵巢組織氧化應激水平變化比較：ELISA法檢測卵巢組織中ROS水平，結果顯示OHSS組卵巢ROS水平顯著高于CTL組(P<0.05)，而發揮清除氧自由基作用的SOD水平顯著低于CTL組(P<0.05)(圖5A、B)。Western blotting及蛋白條帶灰度值分析結果顯示，與CTL組相比，具有抗氧化作用、保護細胞免受應激損傷的轉錄因子Nrf2在OHSS組卵巢組織中表達水平顯著增高(P<0.001)(圖5C、D)。

A、B：兩組大鼠卵巢組織氧化應激水平比較；C、D：兩組大鼠卵巢組織Nrf2蛋白的Western blot結果圖及蛋白條帶灰度分析。與CTL組比較，#P<0.05，*P<0.001。

2.兩組大鼠卵巢組織凋亡相關蛋白的比較：活性氧的增加容易引起細胞凋亡增加。與CTL組相比，OHSS組卵巢內促凋亡蛋白Bax表達顯著減少(P<0.05)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著增加(P<0.05)；p53蛋白、活性caspase-3表達水平同樣顯著減少(均P<0.05)(圖6)。

A：兩組大鼠卵巢組織凋亡相關蛋白(Bax、Bcl-2、p53、Cleaved-caspase3)的western blot結果；B：兩組大鼠卵巢組織凋亡相關蛋白的蛋白條帶灰度值分析。與CTL組比較，#P<0.05。

討 論

本研究采用PMSG聯合HCG構建OHSS模型大鼠[9]。結果發現OHSS組大鼠卵巢組織形態及結構發生顯著改變，卵巢組織自噬水平、氧化應激水平顯著增加，而抗氧化能力及細胞凋亡相關蛋白均顯著下降。本研究首次提出自噬、氧化應激及凋亡在OHSS發生中的作用及相關調節機制。

卵巢體積增大、生殖激素水平增高、血管通透性增加是OHSS的主要表現。本研究發現，OHSS模型組卵巢體積、重量均顯著增加，血清生殖激素水平也顯著升高；HE染色結果顯示，卵巢組織形態學改變主要表現為黃體、血體數目的增加、各級生長卵泡和閉鎖卵泡數目的減少。前期研究發現，OHSS模型大鼠卵巢組織中黃體細胞增殖顯著增加。本研究還發現，OHSS組大鼠卵巢中促凋亡蛋白均顯著減少。卵泡的生長發育與顆粒細胞的增殖與凋亡顯著相關，顆粒細胞凋亡促進卵泡閉鎖的發生[7，12]。本研究結果顯示，OHSS大鼠卵巢組織中閉鎖卵泡顯著減少，且與促凋亡相關蛋白減少、抑制凋亡蛋白增加結果一致。因此，OHSS大鼠卵巢形態學和血清生殖激素高水平的改變可能與卵巢內細胞增殖增加、凋亡減少有關。

在生理水平上，ROS作為細胞信號的次級信使，在卵泡發生、減數分裂和排卵中起著重要的調節作用[13]；在老齡鼠卵巢組織內ROS產生增加，與卵泡發育、炎癥、凋亡密切相關[14]。應激條件下，自噬發揮防止細胞損傷并促進細胞存活的保護功能；ROS可以激活自噬，自噬通過負反饋作用保護細胞，從而維持顆粒細胞的穩定[15-17]。細胞凋亡和自噬之間存在著密切的聯系，一些調節凋亡的基因也可以調節自噬；反之，調節自噬的基因對凋亡也有影響。在自噬發生的最初階段，可以清除細胞內一些有害的的代謝產物，如ROS、錯誤折疊的蛋白等，進而減少凋亡[18]。本研究發現，OHSS大鼠卵巢組織中ROS水平增高、自噬水平增加，同時凋亡相關蛋白表達減少。推測卵巢過度刺激可能通過調節卵巢中氧化應激，誘導自噬水平升高，并進一步減少細胞凋亡，促進卵巢黃體的形成并產生大量激素。

Nrf2具有廣泛的細胞保護作用，是目前認為最重要的抗氧化通路，在應激狀態下Nrf2迅速積累，進入細胞核內調節抗氧化基因表達并發揮保護細胞的作用[19-20]。本研究中OHSS大鼠卵巢組織中Nrf2蛋白水平顯著增高，推測卵巢過度刺激可能上調Nrf2表達發揮其細胞保護作用，清除ROS、降低自噬水平，進而減少卵巢細胞凋亡。

綜上所述，自噬、氧化應激在OHSS卵巢組織結構和功能改變中發揮重要作用。卵巢過度刺激可能通過誘導活性氧增加并導致自噬增加，自噬、Nrf2蛋白同時發揮抗氧化作用、抑制細胞凋亡的作用，最終導致OHSS大鼠血清生殖激素水平顯著增加，黃體組織增多、閉鎖卵泡等生長卵泡減少。細胞自噬是一個復雜的過程，以抑制或者誘導自噬為理論依據的臨床應用，需要更加詳細的體外及體內研究證據。