顯色平板在孕晚期孕婦B族鏈球菌篩查中的應用及B族鏈球菌耐藥性分析＊

周杰 張莉 張娟 凌清松 徐康立 楊書才

B 族鏈球菌（group B Streptococcus， GBS）學名無乳鏈球菌，能引起牛乳房炎，嚴重危害畜牧業，故早期為獸醫界關注。隨著進一步研究發現該菌也能感染人類，尤其是孕產婦和新生兒。GBS常定植于陰道或直腸，妊娠期婦女的帶菌率可達到10%～35%[1-3]。GBS是圍生期孕婦感染的主要致病菌，易導致產褥感染、泌尿生殖道感染、敗血癥、胎膜早破、早產等，在新生兒群體可引起敗血癥、肺炎、腦膜炎等死亡率高的疾病[4-5]。一般而言，約一半的GBS定植孕婦通過母嬰垂直傳播將細菌傳播給新生兒，在沒有產前抗菌藥物預防的情況下，1%～2%的新生兒會出現GBS早發型感染[6]。因此在孕婦陰道/直腸中準確可靠的篩查出GBS，并在生產時給予合適的抗菌藥物進行干預，是預防新生兒GBS早發型感染的關鍵。顯色平板是近些年興起的一種用于細菌培養的新型培養基，GBS顯色平板是在普通培養基的基礎上添加了特異性的酶底物，GBS可以通過酶解作用釋放出顯色原而使菌落呈現紅色或紫紅色，而其他細菌在平板上呈現淡綠色或藍色等顏色。本研究擬通過比較顯色平板與血瓊脂平板對GBS的檢出效果，評價GBS顯色平板的性能，同時對檢出的陽性菌株進行耐藥性分析，為新生兒GBS感染合理抗菌藥物預防、治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年4-12月本院產科門診孕婦標本1 143份，年齡18～45歲，孕35～37周，產科醫生按操作規程采集陰道/直腸拭子。本研究通過本院倫理委員會批準，且患者已簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

VITEK-2全自動細菌鑒定藥敏儀及配套鑒定、藥敏卡（法國生物梅里埃公司）、GBS增菌肉湯管（江門市凱琳貿易有限公司）、哥倫比亞血瓊脂平板（廣州市迪景微生物科技有限公司）、GBS顯色平板（鄭州安圖生物工程有限公司）、M-H血瓊脂平板（溫州市康泰生物科技有限公司）、藥敏紙片（英國OXOID公司）。

1.3 方法

用一次性棉拭子采集孕晚期孕婦陰道下1/3處的分泌物，再將同一拭子插入肛門內1～3 cm，旋轉一圈后取出，1 h內送實驗室。實驗室接到樣本后，將拭子放入GBS肉湯管，于35 ℃、5% CO2培養箱增菌18～24 h。將增菌肉湯混勻，取一接種環分別接種血平板和GBS顯色平板，三區劃線后放35 ℃、5% CO2培養箱培養24～48 h。經過24～48 h培養后，挑取血平板上灰色、周圍有或無β溶血環菌落進行涂片后革蘭染色，如顯微鏡下為革蘭陽性球菌，采用細菌鑒定儀進行鑒定；GBS顯色平板經24～48 h培養后，從上面挑取紅色或紫紅色菌落轉種血瓊脂平板，再經24 h培養，采用細菌鑒定儀進行鑒定。經鑒定為GBS菌株，采用全自動鑒定藥敏儀和配套藥敏卡進行藥敏試驗，對紅霉素耐藥而克林霉素敏感或中介的菌株加做克林霉素誘導試驗（D試驗），如為陽性，判定為克林霉素誘導耐藥。

1.4 統計學處理

本研究數據采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析和處理，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法檢測GBS結果

1 143 例孕晚期孕婦陰道/直腸拭子在顯色平板上生長帶有紅色或紫紅色的菌落151株，經鑒定146株為GBS，GBS陽性率為12.77%，5株非GBS菌株經鑒定4株為溶血葡萄球菌，1株為糞腸球菌。將顯色平板上的GBS轉血瓊脂平板觀察，其中有12株為不溶血GBS。血瓊脂平板上檢測出115株GBS，GBS陽性率為10.06%，見表1。GBS顯色平板陽性率顯著高于血瓊脂平板，兩種方法陽性率比較，差異有統計學意義（χ2=4.16，P=0.041）。

表1 GBS顯色平板與血瓊脂平板檢測結果比較（株）

2.2 藥敏結果

GBS對青霉素、萬古霉素2種抗菌藥物100%敏感；對四環素耐藥率最高，為82.88%；對紅霉素、克林霉素、左旋氧氟沙星的耐藥率分別為63.01%、56.85%、19.18%；對紅霉素耐藥而克林霉素敏感或中介的GBS有8株D試驗陽性，表現出克林霉素誘導性耐藥，本次試驗還檢測出1株對利奈唑胺敏感性降低菌株，見表2。

表2 GBS對抗菌藥物的耐藥情況

3 討論

B族鏈球菌是革蘭陽性兼性厭氧球菌，常定植于女性下消化道和生殖道，是圍生期母嬰感染的重要致病菌。已有的研究分析顯示，不同地區的GBS篩查陽性率存在較大的差異，非洲地區孕婦GBS定植率為18.1%～26.7%，美洲地區為16.7%～22.7%，歐洲地區為16.1%～22.0%，東南亞地區為6.8%～15.3%[7]。美國CDC在2010年發布《圍產期B族鏈球菌相關疾病預防指南》建議對孕35～37周孕婦進行GBS篩查，對篩查陽性孕婦在生產時采取抗菌藥物預防，以降低新生兒感染率和死亡率[8]。

在我國，目前常規的產檢項目沒有包括孕晚期孕婦的GBS篩查，各醫院采取不同的方法進行檢查，導致文獻報道的孕晚期孕婦GBS的定植率差異較大。孟嬋等[9]采用PCR技術檢測GBS的陽性率為7.51%；李相會等[10]采用顯色平板檢測GBS的陽性率為6.30%，均未使用GBS肉湯管進行增菌。金嫻等[11]采用增菌后改良接種培養法檢測GBS的陽性率11.60%，與本研究結果相似。采用GBS肉湯管進行增菌是美國CDC指南中的核心要素，指南中指出，未使用肉湯管進行增菌可能漏掉50%的病例[8]。本次試驗通過先采用GBS肉湯管進行增菌，然后分別轉種GBS顯色平板和血瓊脂平板，陽性率分別為12.77%和10.06%，顯色平板篩查GBS陽性率顯著高于血瓊脂平板，分析原因可能有以下兩個方面：首先是標本通過增菌后，只是單純地抑制了革蘭陰性桿菌，而陰道/直腸中的大量革蘭陽性球菌仍然存在，尤其是糞腸球菌和解沒食子酸鏈球菌，它們與不產溶血環GBS形態非常相似，在血瓊脂平板上很難區分，造成不產溶血環GBS的漏檢；其次是標本中只含有少量的GBS，而含有大量糞腸球菌或其他鏈球菌時，標本轉種在血瓊脂平板上面，只有少量的GBS在第一區和大量的其他細菌混合生長，由于競爭抑制，GBS溶血環不易產生，導致GBS和其他細菌不易區分而造成漏檢。本次分離出4株溶血葡萄球菌和1株糞腸球菌在GBS顯色平板上呈現淡粉紅色菌落，與GBS在顯色平板上生長呈現出紅色或紫紅色有很大區別，易于區分。本次還分離到3株在血瓊脂平板上生長呈黃色的GBS菌落，這與文獻[12]《全國臨床檢驗操作規程》中描述的GBS菌落在血瓊脂平板生長為灰色菌落有所區別，因此在分離到黃色菌落，也要想到有可能為GBS，以免造成漏檢。GBS顯色平板上生長的疑似GBS菌落必須轉種血平板上再進行鑒定，如果直接上機鑒定，機器常鑒定為停乳鏈球菌或假豕鏈球菌，這可能由于GBS在顯色平板上生長不充分造成的。

美國CDC在發布的指南中建議青霉素是產前預防GBS感染的首選藥物，對青霉素過敏的孕婦應進行細菌藥敏試驗，若對紅霉素和克林霉素均為敏感或克林霉素誘導試驗陰性可以采用克林霉素治療，如果克林霉素耐藥或誘導試驗陽性需選用萬古霉素進行治療[8]。越來越多的研究報道指出GBS對紅霉素和克林霉素的耐藥性在逐漸加重，Crespo-Ortiz等[13]對拉丁美洲醫院2個不同階段GBS感染的研究發現，GBS對紅霉素和克林霉素的耐藥性有所增加，紅霉素和克林霉素的耐藥性從1994-2001年的2.8%和5.2%增加到2004-2012年的12.5%和9.4%。Genovese等[14]對孕婦陰道分離的3 494株GBS進行藥敏試驗，GBS對紅霉素和克林霉素的耐藥率分別是40.1%和31.2%。吳麗娟等[15]報道孕晚期孕婦定植的GBS對紅霉素和克林霉素的耐藥率分別為69.73%和66.58%。本研究顯示孕晚期孕婦攜帶的GBS對青霉素和萬古霉素均敏感，對紅霉素和克林霉素的耐藥率分別是63.01%和56.85%，與吳麗娟等[15]報道接近。由于克林霉素耐藥率超過了50%，提示其已經不能作為經驗用藥的抗菌藥物。本次還分離到1株對利奈唑胺敏感性降低GBS，通過查閱文獻，對利奈唑胺敏感性降低或耐藥菌株通常出現在糞腸球菌、葡萄球菌等細菌[16-17]，GBS出現對利奈唑胺敏感性降低，罕有報告，其機制還有待進一步研究。

綜上所述，篩查孕晚期孕婦陰道/直腸定植B族鏈球菌應進行增菌；GBS顯色平板可有效避免其他細菌干擾，培養陽性率顯著高于血瓊脂平板，值得推廣應用；GBS對青霉素依然保持高度敏感，可作為預防用藥；克林霉素耐藥率較高，應根據藥敏試驗結果選擇性用藥。