莪術愈創木烷型倍半萜化合物改善高脂飼料ApoE-/-小鼠脂質代謝和肝臟脂肪變性的機制研究

別玉龍 宋博策 謝蓓莉 劉明旺 史大卓 趙福海

肝臟是脂肪轉化、代謝的重要場所，當循環中血脂升高之后，大量脂質在肝臟實質細胞內沉積，導致肝細胞發生脂肪變性，形成大量脂滴，進一步加劇炎癥反應和氧化應激損傷，加劇肝細胞損傷，導致肝臟功能異常[1]。肝脂酶(hepatic lipase，LIPC)屬于脂肪分解酶家族成員，由肝細胞合成分泌，參與甘油三酯和磷脂的水解過程[2]。同時LIPC位于肝細胞及肝內皮細胞表面，能夠促進高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein, HDL-c)及載脂蛋白-B的攝取，調節肝臟脂肪代謝。研究證明，LIPC與動脈粥樣硬化及冠心病等代謝疾病關系密切[3-4]。

莪術愈創木烷型倍半萜化合物是從中藥莪術中發現的一種新的活性成分。前期研究發現，莪術愈創木烷型倍半萜化合物具有保護血管內皮細胞、抗氧化應激損傷等作用[5]。但莪術愈創木烷型倍半萜化合物是否具有調節脂質代謝、保護肝臟中的作用，尚缺少報道。因此，本研究觀察莪術愈創木烷型倍半萜化合物對高脂飼養ApoE-/-小鼠血脂、肝臟脂質沉積及肝功能的影響，為其臨床轉化應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物 SPF級雄性ApoE-/-小鼠30只，同源雄性C57/BL小鼠10只，體質量(20±2)g，北京維通利華公司提供，合格證書號：SYKX(京)2016-0006。實驗方案獲得西苑醫院動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑及儀器

試劑：莪術愈創木烷型倍半萜化合物，由中國科學院大連化學物理研究所提供。改良蘇木素—伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)試劑盒(批號：9161033)、飽和油紅O染色液(北京索萊寶生物科技有限公司，批號：410K034)；兔抗LIPC抗體(北京博奧森生物技術有限公司，批號：AG03292292)；羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：200061221)；谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST/GOT)測試盒(批號：20201219)、堿性磷酸酶(alanine aminotransferase,AKP)測試盒(批號：20201222)、谷丙轉氨酶(alkaline phosphatase,ALT/GPT)測試盒(批號：20201218)，均購自南京建成生物工程研究所；高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒(批號：201361)、低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒(批號：201441)、甘油三酯測定試劑盒(批號：198021)、膽固醇測定試劑盒(批號：192061)，均購自北京中生北控生物科技股份有限公司；其他試劑為國產分析純。

儀器：多功能酶標儀(美國 biotek公司，型號：synergy2，分析軟件：gen 5)；冰凍切片機(美國Thermo公司，型號：Cryotom e)；全景掃描顯微鏡(日本 Olympus公司，型號：VS120)。

1.3 動物分組與給藥

動物適應性喂養1周后，將ApoE-/-小鼠隨機分為模型組、倍半萜組和阿托伐汀治療組，每組各10只，給予高脂飲食(膽固醇3%、膽酸鈉0.5%、蛋黃粉6%、白糖4%、豬油18%、丙基硫氧嘧啶0.3%、標準飼料68.2%)。正常對照組為同源C57/BL6 小鼠10只，給予普通飼料。小鼠自由飲食、水，明、暗光交替12小時，恒溫、恒濕環境喂養。倍半萜組小鼠給予10 mg/kg劑量生理鹽水混懸，灌胃；阿托伐汀治療組給予10 mg/kg劑量生理鹽水混懸，灌胃；正常對照組、模型組小鼠給予等體積的生理鹽水灌胃。各組小鼠每天灌胃給藥一次，連續給藥12周后取材、處死。

1.4 檢測指標

實驗12周后，4%水合氯醛以0.10 mL/10 g腹腔注射麻醉，固定，打開腹腔，取出肝左外葉，置于4%多聚甲醛固定液中，4℃，24小時充分固定，梯度蔗糖水溶液(10%～30%)脫水，使用OCT冷凍包埋，冰凍切片機切片，厚度為6 μm。

1.4.1 HE染色 切片置于蒸餾水中洗滌10分鐘，蘇木素染色液染色5分鐘，弱酸分化1分鐘，氨水返藍處理2分鐘，伊紅染液染色5分鐘，95%～100%梯度酒精脫水，二甲苯透明1分鐘，2次；中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察肝臟結構并記錄。

1.4.2 油紅O染色 切片置于蒸餾水中洗滌10分鐘；油紅O染液染色15分鐘；60%異丙醇分化5秒后去除雜色；蒸餾水洗滌5分鐘；Mayer蘇木素染色液染色5分鐘，復染細胞核；蒸餾水充分洗滌2分鐘；氨水返藍處理2分鐘，蒸餾水洗滌2分鐘；甘油明膠封片，光學顯微鏡下觀察脂肪滴面積，拍照記錄，每張切片取三個不同視野求平均值，每組取3只小鼠進行分析，Image-Pro plus 6.0軟件分析肝臟脂肪滴占細胞面積比例。

1.4.3 LIPC免疫組織化學染色 切片置于PBS緩沖液洗滌10 分鐘， 3%過氧化氫溶液封閉10 分鐘，10%山羊血清室溫封閉1小時，一抗(1∶200)4℃，12小時，PBS緩沖液洗滌5 分鐘，3次，二抗(1∶200)室溫孵育1小時，PBS緩沖液洗滌5分鐘，3次，DAB顯色液顯色2分鐘，蘇木素染色5分鐘，蒸餾水洗滌，95%～100%梯度酒精脫水，二甲苯透明1分鐘，2次，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察LIPC蛋白表達情況，拍照。每張切片取三個不同視野，每組取3只小鼠進行分析，Image-Pro plus 6.0軟件分析肝臟LIPC表達情況。

1.4.4 血脂、肝功能檢測 小鼠麻醉后主動脈取血，離心取血清，使用中生北控試劑盒進行檢測，酶標儀檢測，具體流程按照說明書進行。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 莪術愈創木烷型倍半萜化合物對小鼠體質量的影響

各組小鼠體質量結果見表1。與入組第1周相比，各組小鼠在第5周后體質量均增加明顯(P<0.01)；與第5周相比，模型組和倍半萜治療組小鼠體質量增加明顯(P<0.05，P<0.01)，空白對照組和阿托伐他汀組小鼠體質量增加不明顯(P>0.05)；和第7周相比，正常對照組和阿托伐他汀組小鼠體質量增加明顯(P<0.01，P<0.05)，倍半萜組和模型組體質量無明顯增加(P>0.05)。各組小鼠體質量同時點相比沒有統計差異(P>0.05)。

表1 莪術愈創木烷型倍半萜化合物對小鼠體質量的影響

2.2 莪術愈創木烷型倍半萜化合物對小鼠血脂水平的影響

各組小鼠血脂水平見表2。與正常對照組相比，模型組小鼠甘油三酯(triacylglycerol, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-c)明顯增加(P<0.01)，HDL-c明顯下降(P<0.01)；與模型組相比，倍半萜組和阿托伐他汀組TC、LDL-c明顯下降(P<0.01)。

表2 莪術愈創木烷型倍半萜化合物對小鼠血脂水平的影響

2.3 莪術愈創木烷型倍半萜化合物對小鼠肝臟脂肪滴沉淀的影響

油紅O染色結果見圖1和表3。正常對照組小鼠肝臟切片僅有少量脂肪沉積，肝細胞致密排列整齊；與正常對照組相比，模型組小鼠肝臟脂肪滴占細胞總面積比例明顯升高(P<0.05)，肝細胞稀疏，排列紊亂；與模型組相比，倍半萜治療組小鼠肝臟脂肪滴細胞總面積比例明顯減少(P<0.05)，部分區域細胞排列紊亂情況有所恢復。阿托伐他汀組小鼠肝臟切片顯示存在大量脂肪滴，細胞間隙增大，排列紊亂。

注： A正常對照組；B模型組；C倍半萜組；D阿托伐他汀組。圖中紅色顆粒為脂肪滴，藍色為細胞核。

表3 莪術愈創木烷型倍半萜化合物對小鼠肝臟脂肪沉積的影響

2.4 莪術愈創木烷型倍半萜化合物對小鼠肝細胞損傷的影響

HE染色觀察莪術愈創木烷型倍半萜化合物對小鼠肝細胞損傷影響，結果顯示：正常對照組小鼠肝臟肝竇區細胞排列緊密，成條索樣分布，結構清晰。模型組小鼠肝臟細胞稀疏，結構紊亂，大量肝細胞呈典型的“氣球樣”改變。倍半萜治療組小鼠肝臟組織中部分區域紊亂明顯恢復。阿托伐他汀組小鼠肝臟細胞稀疏，肝竇結構紊亂加劇。見圖2。

2.5 莪術愈創木烷型倍半萜化合物對小鼠肝臟LIPC蛋白表達的影響

免疫組化法觀察莪術愈創木烷型倍半萜化合物對小鼠肝臟LIPC蛋白表達的影響，結果顯示：與正常對照組小鼠相比，模型組小鼠肝臟LIPC表達明顯降低(P<0.05)。和模型組相比，倍半萜干預后LIPC表達明顯升高(P<0.05)。見圖3、表4。

注：A正常對照組；B模型組；C倍半萜組；D阿托伐他汀組。箭頭表示肝細胞氣球樣變。

注： A 正常對照組；B 模型組；C 倍半萜組；D 阿托伐他汀組。圖中棕色顆粒為LIPC，藍色為細胞核。

表4 莪術愈創木烷型倍半萜化合物對小鼠肝臟LIPC表達的影響

2.6 莪術愈創木烷型倍半萜化合物對小鼠肝功能的影響

各組小鼠ALT、ALP、AST表達水平見表5。與正常對照組相比，模型組小鼠ALT、AST、ALP水平升高明顯(P<0.01，P<0.05)。與模型組比較，倍半萜組小鼠ALT、AST均明顯下降(P<0.01)，阿托伐他汀組小鼠以上指標均無統計學意義。

表5 莪術愈創木烷型倍半萜對小鼠肝功能的影響

3 討論

莪術為活血破瘀藥，具有行氣破血、消積止痛的功效，常用于胸痹心痛、飲食積滯、脘腹脹滿等的治療。莪術中包括姜黃素、莪術醇、β-欖香烯等多種活性成分[6]，研究發現莪術醇具有降低肝指數、血清ALT、AST活性，保護肝細胞，抑制轉化生長因子β1發揮抑制肝臟纖維化的作用[7]；舒泳翔等[8]研究發現姜黃素能夠抑制炎癥因子釋放，抑制肝細胞凋亡。本課題組從莪術中分離出來一種新型莪術愈創木烷型倍半萜化合物，其結構與姜黃素、莪術醇、β-欖香烯不同，同時發現該成分能抑制支架內再狹窄，有良好的保護血管內皮細胞和抑制血管平滑肌細胞增殖的作用[9-10]。此外，進一步研究發現還具有抗氧化活性，能夠保護氧化應激損傷導致的內皮細胞凋亡[5]。

為進一步明確莪術愈創木烷型倍半萜化合物調節脂質代謝，抑制肝臟脂肪變性的作用機制，本實驗觀察了莪術愈創木烷型倍半萜化合物對高脂飼料ApoE-/-小鼠血脂水平和肝臟病理變化的影響。在此基礎上觀察了莪術愈創木烷型倍半萜化合物對肝功能及肝臟脂肪代謝關鍵酶LIPC蛋白表達的影響。結果表明，該成分能明顯降低TC和LDL-c、ALT、AST含量；油紅O染色結果顯示莪術愈創木烷型倍半萜化合物能夠抑制肝臟細胞內脂肪滴形成；HE染色結果發現莪術愈創木烷型倍半萜化合物干預后肝臟組織結構有所恢復，說明該化合物能夠降低高脂飲食誘導的小鼠血清水平，抑制肝細胞脂肪變性，同時能夠保護肝細胞，促進肝功能恢復。為了進一步研究莪術愈創木烷型倍半萜化合物調節脂代謝的機制，課題組采用免疫組化染色方法檢測肝臟組織中LIPC蛋白表達，發現莪術愈創木烷型倍半萜化合物能夠明顯提高肝細胞中LIPC蛋白的表達。LIPC的高表達能夠促進TC和TG分解代謝，提高脂蛋白攝取，調節脂代謝紊亂。本實驗也發現在莪術愈創木烷型倍半萜化合物干預后小鼠肝臟組織中LIPC蛋白表達升高。因此LIPC可能是其發揮調解脂質代謝、減輕肝臟脂肪變性的一個潛在的靶點。綜上，莪術愈創木烷型倍半萜化合物是一種較好的具有調節脂質代謝，保護肝臟功能的新成分，具有進一步研發價值。