長鏈非編碼RNA MCF2L-AS1促進胃癌的增殖、侵襲和遷移

李永志，張鋮，裴俊鵬，張萬川，張春東，2，戴冬秋，3

（1.中國醫科大學附屬第四醫院胃腸外科，沈陽 110032；2.東京大學醫學部胃食道外科，東京 113-0033；3.中國醫科大學附屬第四醫院腫瘤治療中心，沈陽 110032）

胃癌是全球五大常見癌癥之一［1］。胃癌與幽門螺桿菌［2］、高鹽飲食、低水果飲食、飲酒和吸煙等因素相關［3］。近年來胃癌的發病率和死亡率緩慢下降［4］，但全球胃癌患者的5年生存率仍很低［5-6］。因此，研究胃癌進展的生物學分子機制對胃癌的早期診斷和治療具有重大意義。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在細胞核或細胞質中調節基因的表達［7］。它們編碼蛋白質能力較弱［8］。lncRNA參與轉錄調控［9-10］、胚胎發育和疾病進展等過程［11-12］，lncRNA的失調可促進腫瘤的進展［13-14］。

MCF2L基因的變異與骨關節炎有關［15］。MCF2L反義RNA 1（MCF2L-AS1） 是新鑒定出來的位于染色體13q34上的lncRNA，可以調節骨細胞的分化［16］。

本研究通過生物信息學分析和實時定量PCR發現，相對于癌旁非癌胃組織，MCF2L-AS1在胃癌組織中表達升高。本研究還對MCF2L-AS1在胃癌中調節增殖、侵襲和轉移的作用進行分析，并通過癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）和基因本體論（the gene ontology，GO） 數據庫對與MCF2L-AS1相關的mRNA進行了富集分析，以探索MCF2L-AS1可能參與的生物學過程。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的2種胃癌細胞系（HGC-27，AGS）和非癌胃細胞系（GES-1） 購自中國科學院。RPMI-1640培養基和高糖DMEM培養基購自美國Invitrogen公司。胎牛血清購自美國Gibco公司。TRIzol試劑和Lipofectamine 3000試劑購自美國Invitrogen公司。TaKaRa反轉錄試劑盒、TaKaRa實時熒光定量試劑盒購自寶生物工程（大連） 有限公司。siRNA購自上海吉瑪制藥技術有限公司。細胞計數試劑盒8和Transwell 小室購自美國康寧公司。Matrigel（基質膠） 購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 生物信息學分析

利用TCGA數據庫，分析lncRNAMCF2L-AS1在375例胃癌組織和32例癌旁非癌胃組織中的表達水平差異。

1.3 細胞培養

HGC-27細胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養，而AGS和GES-1細胞用含有10%胎牛血清及100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的高糖DMEM培養基培養。在37 ℃和5%CO2的細胞培養箱中培養細胞，培養基每2～3 d更換1次。

1.4 RNA的提取和逆轉錄

使用TRIzol 試劑提取細胞總RNA，并使用分光光度計檢測RNA的濃度和純度。按照試劑盒說明書，使用TaKaRa反轉錄試劑盒對提取的總RNA進行逆轉錄，得到cDNA。

1.5 實時PCR檢測

按照TaKaRa試劑說明書配置試劑混合物，采用TaKaRa實時熒光定量試劑盒對cDNA進行實時熒光定量檢測。以GAPDH為內參，每個樣品重復3次。之后讀取 Ct值，計算靶基因的表達量。lncRNAMCF2L-AS1與內參GAPDH的引物序列見表 1。

表1 引物和si-RNA的序列Tab.1 Sequence of primers and si-RNA

1.6 siRNA轉染

針對MCF2L-AS1設計特異性siRNA（si-MCF2LAS1#1，si-MCF2L-AS1#2） 和陰性對照si-NC（表 1）。將處于對數生長期的細胞接種于培養板，融合＞50%時根據試劑的轉染操作說明進行操作，使用不含血清的培養基稀釋siRNA和Lipofectamine 3000，靜置5 min，混勻后再靜置20 min。棄掉細胞瓶中原有培養基，并用不含血清的培養基洗2遍，之后加入siRNA和Lipofectamine 3000的混合液，將si-MCF2L-AS1（＃1，＃2） 與si-NC轉染到HGC-27和AGS細胞中，4～6 h后更換含有血清的培養基，48 h后用實時PCR檢測轉染前后MCF2L-AS1的表達情況并進行進一步的實驗。

1.7 CCK-8法檢測細胞增殖情況

取轉染48 h后的細胞，計數并調整細胞懸液濃度，每孔加入100 μL細胞懸液，使每孔的細胞數為2 000，每個樣品5個復孔，邊緣孔加等量的無菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS），培養0、24、48、72 h后每孔加10 μL的CCK-8試劑，并繼續在細胞培養箱中孵育2 h，用酶標儀測量各孔在450 nm處的光密度（optical density，OD） 值。

1.8 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力

取轉染48 h后的細胞，將細胞用無血清培養基重懸，制成細胞懸液后調整細胞懸液濃度為1×105/mL，取200 μL的細胞懸液分別加入含基質膠和不含基質膠的小室內，使每個小室內含有20 000個細胞，在下室加入含10% 胎牛血清的培養基。溫育48 h后，細胞遷移或侵襲至小室底部外表面，去除培養基后用PBS洗2遍，之后用多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色15 min。晾干后在顯微鏡下隨機選取6個視野計數并拍照。

1.9 基因富集分析

利用TCGA和GO數據庫預測與lncRNAMCF2L-AS1表達相關的mRNA，并進行基因富集分析。

1.10 統計學分析

所有實驗均重復進行3次，數據以±s表示。采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，采用成對t檢驗進行比較，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA MCF2L-AS1在胃癌組織和細胞中高表達

TCGA數據庫的結果顯示，375例胃癌組織中MCF2L-AS1的表達明顯高于32例癌旁非癌胃組織，差異有統計學意義（P＜ 0.000 1，圖1A）。實時PCR結果顯示，lncRNAMCF2L-AS1在HGC-27和AGS細胞中表達均明顯高于GES-1細胞，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1B。

圖1 lncRNA MCF2L-AS1在胃癌組織與細胞中的表達情況Fig.1 Expression of long noncoding RNA MCF2L-AS1 in gastric cancer

2.2 敲低MCF2L-AS1抑制HGC-27和AGS細胞的增殖遷移和侵襲

在HGC-27和AGS細胞中敲低MCF2L-AS1，實時PCR結果顯示，si-MCF2L-AS1#2敲低的效果更明顯（圖2A）。因此后續研究采用si-MCF2L-AS1#2作為敲低MCF2L-AS1的siRNA。

CCK-8法檢測MCF2L-AS1對HGC-27和AGS細胞增殖的影響。結果顯示，與對照組相比，MCF2L-AS1敲低后的HGC-27和AGS細胞增殖能力下降（P＜ 0.05），見圖2B。

Transwell方法檢測MCF2L-AS1對HGC-27和AGS細胞遷移和侵襲能力的影響。結果顯示，與對照組相比，MCF2L-AS1敲低后HGC-27和AGS細胞遷移和侵襲能力均下降（P均＜0.05），見圖2C、2D。

圖2 敲低胃癌細胞中長鏈非編碼RNA MCF2L-AS1對胃癌細胞增殖侵襲和遷移能力的影響Fig.2 The effect of MCF2L-AS1 knockdown on the proliferation，invasion，and migration of gastric cancer cells

2.3 MCF2L-AS1與細胞周期等生物學過程密切相關

利用TCGA和GO數據庫預測了與MCF2L-AS1相關的mRNA，并通過富集分析發現MCF2L-AS1可能與細胞周期、微管細胞骨架組織、減數分裂的細胞周期和有絲分裂激酶B通路等密切相關，見圖3。

圖3 與MCF2L-AS1相關的mRNA功能富集分析結果Fig.3 Enrichment analysis results of mRNA associated with MCF2L-AS1

3 討論

在過去的幾十年中，盡管胃癌的診斷和治療方法取得了顯著進展，但由于癌癥的復發和轉移，全球胃癌患者的5年生存率仍然很低［5-6］。因此，詳細研究胃癌發生發展的分子機制對于尋找治療胃癌的新靶點和新策略至關重要。

lncRNA是一類RNA分子，其轉錄本＞200個核苷酸。它們被RNA聚合酶Ⅱ轉錄，優先定位于細胞核中，調節順式或反式基因的表達。而且，具有類似于mRNA共有序列的3’切割和聚腺苷酸化特征的lncRNA可以輸出至細胞質執行細胞質功能［7］。在人類基因組中，lncRNA作為常見的表觀遺傳調控分子，在表觀遺傳學中發揮重要作用，并參與轉錄調控，包括RNA剪切和修飾、mRNA穩定和翻譯、蛋白質穩定和運輸、染色體形成和結構穩定性［9-10］。它們參與調節胚胎發育，組織分化，器官形成以及某些疾病的發生和發展［11-12］。lncRNA的失調可通過調節增殖、侵襲和轉移來促進腫瘤發生并促進癌癥的發展［13-14］。許多研究［17-18］表明，lncRNA在胃癌發生發展的復雜機制中發揮著不可或缺的作用［19-21］。

MCF2L基因編碼一個鳥嘌呤核苷酸交換因子，與三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP） 結合的Rac1可與該因子特異性相互作用，并在Rho/Rac信號通路中起作用［15］。MCF2L反義RNA 1（MCF2L-AS1）是最近新發現的lncRNA。CHEN等［16］發現MCF2L-AS1能控制成骨分化，HUANG等［22］和ZHANG等［23］發現MCF2L-AS1在結直腸癌中過表達，并且促進結直腸癌的增殖侵襲和遷移。本研究探討了MCF2L-AS1在胃癌中的表達情況，并分析了MCF2L-AS1在胃癌中的潛在作用。生物信息學分析結果顯示，MCF2L-AS1在胃癌組織中的表達顯著上調，實時PCR檢測結果顯示，在HGC-27和AGS細胞中發現MCF2L-AS1的表達水平的確明顯高于非癌胃細胞GES-1。敲低MCF2L-AS1后，CCK-8實驗發現胃癌細胞的增值能力明顯減弱。進而通過Transwell實驗發現，敲低MCF2L-AS1后，胃癌細胞的侵襲和遷移能力也受到抑制。最后，采用TCGA和GO數據庫對MCF2L-AS1相關的mRNA進行了富集分析，發現其可能與細胞周期等生物學過程密切相關。因此，推測lncRNAMCF2L-AS1在胃癌中過表達，并且這種過表達促進了胃癌的增殖侵襲和遷移。然而，MCF2L-AS1在胃癌中發揮作用的具體分子機制以及MCF2L-AS1所涉及的信號通路還有待進一步研究。

綜上所述，本研究證實了MCF2L-AS1在胃癌中過表達，而且MCF2L-AS1通過促進胃癌的增殖、侵襲和遷移在胃癌中發揮促癌作用。