澳洲茄堿對壓力超負荷誘導的小鼠心肌纖維化的影響*

汪銘煜 郭振 楊政 樊迪 唐其柱

(武漢大學人民醫院 1.心血管內科；2.代謝與相關慢病湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430060)

心肌纖維化(Myocardial fibrosis, MF)是心臟在各種內外環境刺激下發生的病理性改變，主要表現為細胞外基質(Extracellular matrix, ECM)的過度沉積和心肌成纖維細胞(Cardiac fibroblasts, CFs)的增殖，是影響心血管疾病預后的重要因素[1]。MF可導致心室壁僵硬、心室順應性下降、心臟舒張功能受損，從而影響心臟的正常功能，最終進展為心力衰竭[2-4]。澳洲茄堿(Solaso nine, SS)是一種含有甾體結構的糖苷生物堿，是藥用植物龍葵的主要活性成分，對肝癌、宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病等多種腫瘤均有抑制作用[5-8]。既往研究表明，SS具有抑制血管生成、抑制腫瘤細胞轉移、誘導細胞凋亡、調節微管系統等作用[9-12]。并且，SS可通過調節p38 MAPK及Akt信號通路抑制腫瘤細胞增殖，而這兩個信號通路均與MF的發生發展相關[8,10,13]。因此，本研究認為SS可能通過調節p38 MAPK及Akt信號通路改善MF。本研究主要采用主動脈縮窄術(Aortic banding,AB)建立小鼠心臟纖維化模型，探討SS對小鼠MF的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 SS購自上海融禾醫藥科技發展有限公司，高效液相色譜法(HPLC)檢測純度>98%。GAPDH(9315)、P-p38 MAPK(4511)、T-p38 MAPK(9212)、P-Akt(4060)、T-Akt(4691)均購于CST公司。羊抗兔二抗(美國CST公司，7074)；RIPA裂解液(美國賽默飛世爾公司，89900)；Trizol試劑(美國賽默飛世爾公司，15596)；反轉錄試劑盒和實時PCR(real-timePCR，RT-PCR)試劑(瑞士Roche公司，4896866001)，SYBRGreen I Master(瑞士Roche公司，4707516001)。定量RT-PCR儀(瑞士Roche公司，型號：LC480)，酶標儀(美國伯騰儀器有限公司，Synergy HT)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型 選取8～10周齡雄性C57/BL6小鼠40只，體質量23.5～27.5 g，購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，飼養于武漢大學人民醫院心血管病研究所，飼養環境SPF級。所有針對于動物的實驗均通過武漢大學動物護理和使用委員會批準。小鼠適應性喂養1周后，采用隨機數字表法將C57小鼠分為假手術組、假手術組+SS組、AB組、AB+SS組，每組10只。AB+SS組接受AB手術3周后，每天腹腔注射SS(10 mg/kg)；AB組接受AB手術3周后，每天腹腔注射等量的生理鹽水；假手術+SS組接受假手術處理(不結扎主動脈，其余步驟一致)3周后，每天腹腔注射SS(10 mg/kg)；假手術組接受假手術處理3周后，每天腹腔注射等量的生理鹽水。腹腔注射持續1周。

1.2.2 心功能測量及取材 各組小鼠完成腹腔注射處理后，于異氟烷吸入麻醉下行心臟超聲檢查，評估心功能情況[左室舒張末期內徑(LVEDD]、左室射血分數(LVEF)及左室短軸縮短率(LVFS)]。完成測量后處死小鼠并收集心臟標本，用于病理染色及分子生物學檢測。

1.2.3 病理染色 經4%甲醛溶液固定的心臟脫水，石蠟包埋切片后，進行天狼猩紅染色(PSR)。

1.2.4 分子生物學檢測 采用免疫印跡法(Western blot)檢測心肌纖維化相關分子。取心臟組織或心臟成纖維細胞，研磨后加入RIPA裂解液進行裂解，提取蛋白并定量。每孔蛋白上樣量50 μg進行SDS-PAGE電泳。轉膜，封閉后分別孵育一抗GAPDH抗體、P-p38 MAPK抗體、T-p38 MAPK抗體、P-Akt抗體、T-Akt抗體4℃過夜，次日二抗孵育1 h后顯色。以GAPDH作為內參，采用Image-ProPlus6.0軟件檢測各條帶的吸光度(A)值。RT-PCR檢測MF標志物mRNA的表達：取心臟組織或心臟CFs，Trizol法提取總mRNA，取2 μg mRNA反轉錄合成cDNA，建立PCR反應體系，檢測mRNA表達水平。相關引物序列見表1。

表1 RT-PCR檢測相關基因的引物序列

1.3 p38 MAPK抑制實驗 將原代大鼠心臟成纖維細胞接種到六孔板上培養。分別加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、10 ng/mL TGF-β1、PBS+50 μmol/L SS、10 ng/mL TGF-β1+50 μmol/L SS、PBS+1 μmol/L p38 MAPK抑制劑、10 ng/mL TGF-β1+1 μmol/L p38 MAPK抑制劑。24 h后收集各組細胞進行分子生物學檢測。

2 結果

2.1 各組小鼠心臟功能比較 AB組心重/體重(HW/BW)及心重/脛骨長(HW/TL)比值均明顯高于假手術組(P<0.05)；而AB+SS組比值均明顯低于AB組(P<0.05)(圖1)。AB+SS組LVEDD明顯小于AB組，而LVEF及LVFS均明顯高于AB組(P<0.05)(表2)。上述結果表明，AB手術成功誘導了小鼠心功能不全，而SS改善了AB誘導的小鼠心功能不全。

圖1 各組小鼠心重/體重及心重/脛骨長比值

表2 各組小鼠心臟超聲指標

2.2 各組小鼠MF程度 PSR染色后觀察，AB組小鼠心臟的間質及血管周圍纖維化程度明顯高于假手術組，而AB+SS組小鼠心臟的間質及血管周圍纖維化程度顯著低于AB組(均P<0.05)。AB組小鼠心肌組織COL-1 mRNA、COL-3 mRNA、TGF-β mRNA相對表達水平與假手術組相比明顯升高(3.53±0.48vs1.00±0.11、4.87±0.81vs1.00±0.14、2.87±0.52vs1.00±0.18)，差異均有統計學意義(P<0.05)；AB+SS組小鼠心肌組織上述指標明顯低于AB組(1.89±0.41vs3.53±0.48、1.81±0.73vs4.87±0.81、1.64±0.46vs2.87±0.52)，差異有統計學意義(均P<0.05)，見圖2。

圖2 各組小鼠心肌組織纖維化程度

2.3 SS對小鼠MF相關信號通路的影響 Western blot結果顯示，AB組小鼠心肌組織中的p38 MAPK蛋白的磷酸化水平明顯高于假手術組(2.66±0.51vs1.00±0.09，P<0.05)，AB+SS組的p38 MAPK蛋白的磷酸化水平低于AB組(1.39±0.32vs2.66±0.51,P<0.05)；而Akt蛋白的磷酸化水平沒有顯著性差異(P>0.05),見圖3。

圖3 各組小鼠心肌組織p38 MAPK及Akt信號通路蛋白表達及磷酸化情況

2.4 SS對心肌細胞纖維化的影響 RT-PCR檢測結果顯示，TGF-β1+p38 MAPK 特異性抑制劑(SB203580)組和TGF-β1+SS組的COL-1、COL-3、TGF-β mRNA水平均顯著低于TGF-β1+PBS組(2.31±0.43，2.24±0.52vs4.98±1.42；1.78±0.28，1.71±0.33vs5.11±1.36；1.62±0.27，1.59±0.41vs3.66±0.54, 均P<0.05)，見圖4。

圖4 心肌成纖維細胞纖維化相關基因mRNA表達水平

3 討論

心肌成纖維細胞的激活是MF發生發展的重要環節。活化的心肌成纖維細胞在多種細胞因子的作用下轉化為肌成纖維細胞，分泌大量Ⅰ型、Ⅲ膠原蛋白及其他基質蛋白，最終導致膠原沉積及心臟纖維化[14-15]。盡管MF在早期是維持心臟結構完整，防止心臟功能障礙的適應性反應，但這些變化最終將導致心臟的惡性重構，進而發展為心力衰竭[3,16]。目前仍然沒有針對MF的特異性治療方法，探索新的有效治療措施十分重要。

MF的發生發展與TGF-β/Smads信號通路、MAPK通路、Akt信號通路等有關[17-18]。其中，p38 MAPK是MAPKs家族的主要成員之一，在心肌肥厚、心室重構、心肌細胞凋亡中發揮著重要的作用[19-20]。抑制p38 MAPK活性可降低TGF-β誘導的CFs轉化，減少小鼠胚胎成纖維細胞中膠原、纖連蛋白及α-SMA的表達，而過表達p38 MAPK則可誘導CFs向肌成纖維細胞轉化[21]。此外，體內實驗發現，抑制p38 MAPK不但能減輕心肌梗死后纖維化及α-SMA的表達，還能明顯提高缺氧或肺動脈縮窄誘導的小鼠右心室重構，進而改善心臟功能[22]。已有研究表明，SS通過調節p38 MAPK途徑從而抑制神經膠原瘤的生長，但其在心臟中的作用仍不明確[23]。

本研究發現，SS干預可明顯減輕AB誘導的MF，下調MF標志物(COL-1、COL-3、TGF-β)的mRNA表達水平，同時降低了p38 MAPK的磷酸化水平，改善心臟功能。體外細胞實驗進一步發現，使用p38 MAPK抑制劑與SS干預均可使心肌纖維化標志物的mRNA表達水平下降，提示SS可能通過p38 MAPK通路發揮其抗纖維化作用。

4 結論

澳洲茄堿可改善主動脈縮窄術誘導的小鼠心臟功能障礙及心肌纖維化，并抑制其向肌成纖維細胞轉化。澳洲茄堿抗纖維化的作用可能與抑制p38 MAPK磷酸化水平相關，但其具體機制仍需要進一步探究。