清熱化瘀方對腦缺血再灌注大鼠腦組織氧化應激反應的影響及機制*

秦紅玲 農必華 盧健鋒 林榮清 李曉瓊 楊璧璘 胡躍強

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023)

缺血性腦卒中(Cerebral ischemic stroke，CIS)是多因素所致的腦組織血液供應障礙性疾病。目前早期恢復血液供應是急性CIS治療的目標，但它進一步加重了由于缺血再灌注(Ischemia/reperfusion, I/R)引起的神經元損傷[1]。氧化應激是腦I / R損傷的主要機制，開發具有抗氧化作用的神經保護劑是治療CIS的有效策略。清熱化瘀方是本課題組研制的中藥復方，主要用于治療腦梗死[2]，具有解毒、化痰祛瘀之功效。前期研究證實，清熱化瘀方可顯著降低神經元氧化應激損傷，其可能通過激活Keap1/Nrf2內源性抗氧化應激通路，進而改善大鼠腦I/R損傷[3-4]。MicroRNA(miRNA)是調控人類約20%～30%基因表達的關鍵因子[5]，并在腦I/R損傷的進程中起調控作用[6]。本研究采用TargetScan預測，結果顯示Keap1是miR-18a-3p的潛在靶標；預實驗發現miR-18a-3p在清熱化瘀方治療I/R大鼠腦組織中存在差異表達，提示清熱化瘀方改善腦I/R損傷的機制可能與miR-18a-3p和Keap1/Nrf2通路有關。因此，本研究旨在深入探討清熱化瘀方對I/R大鼠腦組織氧化應激反應的影響及作用機制，為清熱化瘀方的臨床應用提供更多的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠由廣西醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK2016-0002。清熱化瘀方(水牛角30 g、丹參15 g、赤芍15 g、地龍10 g、石菖蒲10 g、川芎10 g、郁金10 g、酒大黃6 g、天竺黃10 g，共9味中藥)單味中藥濃縮顆粒劑，由江陰天江藥業有限公司制備(批號：0904099)。293T細胞(SCSP-502)購于中科院上海細胞庫，DMEM(Invitrogen, 11960044)，FBS(Gibco)，pmirGLO載體(Promega, Madison, WI)，Lipofectamine 2000(Invitrogen)，雙熒光素酶報告基因檢測系統(Promega)，Keap1用網站預測(http://www.targetscan.org)與miR-18a-3p結合序列，miR-18a-3p mimics與mimics-NC均由廣州銳博公司合成。Keap1抗體(ab139729)、Nrf2抗體(ab92946)、NOX-2抗體(ab129068)、NOX-4抗體(ab154244)、HO-1抗體(ab68477)、SOD2抗體(ab13533)、山羊抗兔HRP-IgG(ab6721)、β-actin(ab8227)、H3(ab1791)均為abcam產品，總RNA提取試劑盒(R6834)，逆轉錄試劑盒(RR047A)，miScript 逆轉錄試劑盒(Qiagen)，Realtime PCR試劑盒(RR820A)，ROS檢測試劑盒為酶聯生物產品。細胞核和細胞質蛋白抽提試劑盒為碧云天產品(P0027)。氯化三苯基四氮唑(TCC)染色液(北京鼎國，批號：16S08342)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 32只SD大鼠，250～300 g，16～20周齡，于SPF條件下飼養，分為正常組、假手術組、模型組、清熱化瘀方組，每組8只。除正常組外，其余各組均采用線栓法進行處理。動物實驗均符合動物倫理要求，并經醫院倫理委員會審核同意。

1.2.2 動物模型建立 采用大鼠大腦中動脈梗阻(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，參照Longa[7]線栓法進行，再灌注后規定時間點處死動物。假手術組：以假手術代替I/R，線栓只插入頸內動脈9 mm，不栓塞大腦中動脈。模型組和清熱化瘀方組線栓插入頸內動脈17～21 mm阻斷血流，缺血2 h，制備腦缺血模型，缺血后去除線栓再灌注24 h。清熱化瘀方組灌胃清熱化瘀方劑，灌胃液體量為每次1.4 mL/100 g大鼠，其濃度及等效劑量按體表面積折算，2次/d。正常組、假手術組、模型組均灌胃等體積生理鹽水。各組均正常飼養，自由飲水，4天后處死取缺血灶周圍腦組織進行檢測。模型制備后，用4%多聚甲醛灌注后，斷頭處死，取大腦組織，由前至后冠狀切面，約200 μm左右厚度，每個大腦切5個層面，放入2% TTC溶液中染色，通過TTC染色法以觀察腦梗死區域的分布情況，以驗證模型制備成功。

1.2.3 RT-qPCR法測定miR-18a-3p、Keap-1、Nox-2、Nox-4、HO-1和SOD2的表達 用RNA提取試劑盒提取各組細胞總RNA，進行逆轉錄及實時熒光定量PCR反應，按操作說明書進行。PCR程序：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，40個循環。引物由華大基因合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 Western blot檢測Keap-1、Nox-2、Nox-4、HO-1、SOD2蛋白表達及Nrf2核轉位 裂解組織提取蛋白，BCA法蛋白定量，蛋白變性后取50 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法轉移蛋白至PVDF膜，以含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉2 h，分別孵育一抗Keap-1、Nrf2、Nox-2、Nox-4、HO-1和SOD2， 4℃孵育過夜，TBST振搖洗膜10 min×4次，孵育相應種屬的HRP標記二抗，室溫1 h，TBST振搖洗膜10 min×4次。ECL底物化學發光顯色后機器掃描存盤，以Image軟件進行條帶分析。其中Nrf2蛋白表達量以組蛋白H3作為內參，其余蛋白表達量均以β-actin作為內參。

Nrf2蛋白采用細胞核和細胞質蛋白抽提試劑盒提取，具體方法為將10倍體積的胞質蛋白抽提試劑A裂解液加入腦組織中，震蕩5 s，加入1/2體積試劑B，震蕩5 s，冰浴1 min。4℃、13000×g離心5 min，所得上清為胞質蛋白。再往沉淀加入2倍體積的含細胞核提取試劑，震蕩30 s，冰浴30 min，期間每隔1～2 min渦旋 30 s，13000×g離心5 min，上清為胞核蛋白。

1.2.5 Elisa法檢測腦組織ROS表達 按ROS Elisa檢測試劑盒說明要求制備腦組織勻漿，1000×g離心10 min取上清，并用標本稀釋液按1∶1稀釋待用。平衡試劑盒至室溫并充分混勻，制備標準品。取出加樣板條，設置標準孔和樣品孔。標準孔加相應濃度的標準品50 μL，樣品孔加入50 μL稀釋好的待檢樣品。立即加入50 μL的生物素標記的抗體，用封板膜封板，輕輕震蕩混勻，于37℃恒溫箱孵育1 h。棄反應液，吸水紙上拍干，每孔加入300 μL震蕩洗滌液30 s，棄液拍干，重復洗滌3次，拍干。每孔加入80 μL的親和鏈霉素-HRP，封板，輕輕震蕩混勻，于37℃恒溫箱孵育30 min，再次按要求洗滌3次。每孔加入底物A、B各50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光孵育10 min，每孔立即加入50 μL終止液，立即用酶標儀于450 nm波長處讀取各孔OD值。繪制標準品線性回歸曲線，并按方程計算各樣本中ROS的含量。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測 293T細胞按說明書要求用含10% FBS的DMEM培養于37℃、5% CO2培養箱中。將Keap1基因的3 ′UTR WT(WT-Keap1 3′UTR)及其突變體(MUT -Keap1 3 ′UTR)構建到pmirGLO載體中，該載體的熒光素酶luc2作為主要報告基因，熒光素酶hRluc-neo為對照報告基因，不含任何外源片段的pmirGLO載體作為空載對照。根據Lipofectamine 2000轉染說明書要求，將miR-18a-3p mimics與mimics-NC 分別與熒光素報告基因共轉染到293T細胞中，分別為WT-Keap1組、MUT-Keap1組和Vector組，每組設置3個復孔，轉染后培養12 h，用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光素酶活性，以海參熒光素酶hRluc-neo的活性作為對照報告基因。實驗重復3次。

2 結果

2.1 模型組大鼠腦組織TTC染色 選取再灌注24 h后的模型組大鼠腦組織行TTC染色，模型制備成功的腦組織中，正常腦組織呈玫瑰紅色，缺血損傷的腦組織呈蒼白色，可見明顯的梗死灶，見圖1。

圖1 模型大鼠腦組織TTC染色切片

2.2 清熱化瘀方對大鼠腦組織Nox-2、Nox-4表達及ROS生成的影響 采用Western blot、RT-qPCR和ELISA分別檢測大鼠腦組織Nox-2、Nox-4的表達、ROS生成量，結果顯示，與正常組相比，模型組缺血灶腦組織中Nox-2、Nox-4 mRNA和蛋白表達量顯著升高，ROS的生成量顯著升高(均P<0.05)；與模型組相比，清熱化瘀方組Nox-2、Nox-4 mRNA和蛋白表達量顯著降低，ROS產生量顯著降低(均P<0.05)；假手術組與正常組的檢測結果相比，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組Nox-2、Nox-4和ROS檢測結果(n=8)

2.3 清熱化瘀方對大鼠腦組織Keap1、SOD2、HO-1表達及Nrf2核轉位的影響 采用Western blot和RT-qPCR法檢測各組大鼠腦組織Keap1、SOD2、HO-1表達和Nrf2核轉位。結果顯示，與正常組相比，模型組Keap1 mRNA及蛋白表達顯著升高，SOD2、HO-1 mRNA和蛋白表達及Nrf2核轉位顯著降低(均P<0.05)；與模型組相比，清熱化瘀方組Keap1 mRNA及蛋白表達顯著降低，而SOD2、HO-1 mRNA和蛋白表達及Nrf2核轉位顯著增加(均P<0.05)；假手術組與正常組的檢測結果比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組Keap1、SOD2、HO-1和Nrf2的檢測結果(n=8)

2.4 清熱化瘀方對大鼠腦組織miR-18a-3p表達的影響 采用RT-qPCR法檢測各組大鼠腦組織中miR-18a-3p表達。結果顯示，與正常組相比，模型組miR-18a-3p的表達顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，清熱化瘀方組miR-18a-3p的表達量顯著升高(P<0.05)。假手術組與正常組的檢測結果比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組miR-18a-3p檢測結果(n=8)

2.5 雙熒光素酶報告基因實驗證實miR-18a-3p與Keap1結合 使用雙熒光素酶報告基因實驗檢驗miR-18a-3p與Keap1的相互作用，結果顯示，與陰性對照相比，過表達miR-18a-3p能顯著至弱WT-Keap1組熒光活性(P<0.05)，而MUT-Keap1組熒光活性無明顯抑制作用(P>0.05)，miR-18a-3p可與野生型Keap1 3′UTR直接結合，見圖5。

圖5 雙熒光素酶報告基因實驗結果(n=3)

3 討論

CIS的治療方法是早期恢復血流再灌注，進行血流重建術，保證血氧供應，但當腦缺血超過一定時間后，缺血再灌注使神經元產生一系列級聯反應，進一步加重腦組織損傷，即腦I/R損傷。故神經保護藥物在腦I/R損傷治療研究中備受關注。近年來，中醫藥以其多靶點、多途徑等優勢已成為中風疾病治療研究中的熱點[8]。中風病的主要病機為毒損腦絡，痰瘀阻滯，氣血逆亂，而痰毒、瘀毒、熱毒往往交織為患，故“清熱解毒，化瘀通絡”是其有效治法。本研究研制的清熱化瘀方具有解毒、化痰祛瘀之功效，是治療中風病的有效方劑。前期大量研究表明，該方可通過抗氧化、抗炎和抗凋亡等多種途徑改善缺血性腦損傷，對腦I/R損傷具有顯著的保護作用[9]，表明清熱化瘀方作為神經保護劑在臨床應用中具有一定的價值。因此，深入探討清熱化瘀方對腦I/R損傷的保護效應具有重要的意義。

腦I/R損傷是一個復雜的病理生理過程，其機制包括能量衰竭、細胞內Ca2+的積累、氧化應激、炎癥[10]和細胞凋亡等[11]。氧化應激在CIS腦損傷過程中發揮關鍵作用[12]。急性缺血性中風后，ROS的迅速增加會迅速壓倒抗氧化防御，造成腦組織損傷；這些ROS可損傷細胞大分子，誘導神經元自噬、凋亡和壞死等；此外，血流的快速恢復增加了組織氧合水平，導致ROS產生的第二次爆發，從而導致再灌注損傷，進一步加重腦組織損傷[13]。NADPH氧化酶的非吞噬細胞氧化酶(NOX)家族是腦缺血氧化應激中產生ROS的主要體系。當大腦受到氧化應激時，NOX家族被激活，使電子從NADPH轉移到氧分子中，從而產生大量的ROS[14]。Nox-2、Nox-4主要分布于腦組織中，是NOX家族介導腦損傷的關鍵亞型。既往研究發現，Nox4-/-小鼠在局灶性MCAO模型中，梗死體積、氧化應激、血腦屏障破壞和神經元凋亡均顯著減少[15]。此外，Nox-2誘導ROS生成增多可進一步促進腦I/R大鼠的炎癥反應[16]。本研究發現，相較于正常組，模型組缺血腦組織中ROS的生成量顯著升高，但清熱化瘀方治療腦I/R大鼠后，可明顯降低腦缺血組織中ROS含量，表明腦I/R造成了嚴重的氧化應激損傷，而清熱化瘀方有助于改善腦I/R引起的氧化應激損傷，其可通過抑制Nox-2和Nox-4的表達和ROS生成，從而抑制腦I/R所致的氧化應激損傷。

Keap1/Nrf2是生物體的內源性抗氧化通路。Keap1是Nrf2的天然抑制劑，正常生理狀態下兩者結合，誘導Nrf2泛素化并隨后被26S蛋白酶體降解，從而阻止Nrf2的核轉位及其與ARE序列的結合(Nrf2激活)，維持其活性的穩定；當細胞受到ROS刺激后，Nrf2與Keap1解偶聯，Nrf2激活，從而促進下游含ARE序列的抗氧化劑基因的轉錄，例如HO-1、SOD等，進而在腦I/R損傷中發揮抗氧化作用[17]。HO-1可催化血紅素氧化生成游離鐵、膽綠素和CO，阻止游離血紅素參與氧化反應，發揮抗氧化、抗炎以及抑制細胞凋亡等作用[18]。SOD是機體重要的抗氧化酶，可通過歧化反應清除氧自由基并阻斷脂質過氧化反應。根據結合金屬離子種類，SOD分為SOD1、SOD2和SOD3。SOD2(Mn-SOD)存在于線粒體內，參與保護細胞免受氧化應激，在腦I/R損傷中起著神經保護作用[19-20]。大量研究證實，Nrf2的缺失或下降會加劇腦I/R大鼠的腦梗塞和神經功能缺損，并降低下游抗氧化酶的表達[21-22]。本研究發現，相較于正常組，腦I/R大鼠損傷后，其腦缺血組織的Keap1表達升高，Nrf2核轉位及HO-1和SOD2的表達顯著降低，但清熱化瘀方可明顯促進腦I/R損傷組織中Nrf2核轉位及HO-1和SOD2的表達，抑制Keap1表達，表明腦I/R損傷減弱了機體的抗氧化防御機制，而清熱化瘀方可顯著增強內源性抗氧化劑防御的能力，且可通過抑制Keap1表達，激活Nrf2信號通路，具有顯著的抗氧化效應，進一步說明激活Nrf2介導的抗氧化機制可抑制腦I/R損傷。

miRNA是一種短鏈的非編碼單鏈RNA，通過與目標mRNA的3′UTR結合來抑制基因表達。近年來越來越多的研究證實，miRNA的異常表達與CIS的發生、發展、治療及預后均有密切聯系。干擾miR-129-5p表達逆轉了金錢草提取物對I/R大鼠腦損傷的保護作用[23]，表明miRNA在藥物改善腦I/R損傷中起關鍵作用。另外，miR-34b可通過直接靶向抑制Keap1蛋白水平，增加Nrf2和HO-1的表達，進而對腦I/R大鼠誘導的氧化應激損傷發揮保護作用[24]，表明Keap1/Nrf2在腦I/R損傷中的抗氧化機制可能受miRNA的調控。人參皂苷Rg1可通過抑制miR-144的表達，進而促進miR-144下游靶標Nrf2的轉錄水平，從而減輕I/R后的氧化應激損傷[25]，進一步提示神經保護劑在腦I/R損傷中的抗氧化效應與miRNA有關。本研究發現，TargetScan預測結果顯示，Keap1是miR-18a-3p的潛在靶標，經雙熒光素酶報告基因檢測結果證實，miR-18a-3p靶向Keap1基因的3′UTR；并且，miR-18a-3p在腦I/R大鼠模型腦組織中的表達顯著低于正常大鼠，而清熱化瘀方治療腦I/R大鼠后，可顯著上調miR-18a-3p的表達，表明miR-18a-3p參與了腦I/R損傷機制，且清熱化瘀方對腦I/R的抗氧化作用機制與miR-18a-3p密切有關。

4 結論

清熱化瘀方是治療腦I/R損傷的有效方劑，可有效抑制腦I/R大鼠腦組織氧化應激反應，其機制可能與促進缺血腦組織miR-18a-3p表達，進而抑制Keap1表達，促進Nrf2核轉位有關，這進一步表明清熱化瘀方作為神經保護劑在臨床應用方面具有較高的價值。腦I/R損傷是一個復雜的病理生理過程，涉及多種機制與多條信號通路，且清熱化瘀方也具有多種效用，故清熱化瘀方改善腦I/R損傷的效應與機制仍需要深入探討。