circUCK2靶向miR-483-5p調控oxLDL誘導的血管內皮細胞氧化應激和細胞凋亡機制研究

李平 徐虹 王文志 范雷雷 王濤

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是與氧化應激和內皮功能障礙有關的一種慢性血管性疾病，其初始階段與血管內皮損傷密切相關，且氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)在是動脈粥樣硬化發展的關鍵因素之一；闡明參與內皮細胞氧化應激和凋亡的機制可為相關的疾病提供新的治療靶點[1-3]。環狀RNA(circRNA)是一種新型的非編碼RNA，在許多人類疾病中其均異常表達，研究circRNA在血管疾病中的功能，可為血管疾病的治療提供新靶點[4]。如circ_0124644通過充當miR-149-5p的海綿體來調節PAPP-A，從而加劇ox-LDL誘導的人血管內皮細胞內皮損傷[5]。CircBPTF通過介導miR-384/LIN28B軸來防止高糖引起的人臍靜脈內皮細胞炎癥性損傷和氧化應激[6]。研究報道circUCK2的過表達通過miR-125b-5p/GDF11信號傳導減弱腦缺血再灌注損傷中的細胞凋亡[7]。然而circUCK2對oxLDL誘導的血管內皮細胞氧化應激和細胞凋亡的影響及機制尚不清楚。miR-483-5p是一種嵌入胰島素樣生長因子2(Igf2)內含子中的microRNA，可作為內源性血管生成抑制因子[8]。miR-483-5p在成纖維細胞和內皮細胞中的過度表達調節了纖維化相關基因的表達[9]。膿毒癥誘導的急性肺損傷小鼠的肺組織中miR-483-5p上調；沉默miR-483-5p可以有效減輕敗血癥誘導的急性肺損傷，并抑制脂多糖處理的肺微血管內皮細胞(PMVEC)細胞的炎癥和凋亡[10]。因此，本實驗旨在研究circUCK2是否通過調控miR-483-5p影響oxLDL誘導的血管內皮細胞氧化應激和細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 細胞主要試劑 人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司；氧化低密度脂蛋白(oxLDL)購自上海魯汶生物科技有限公司；DMEM培養液購自美國Gibco公司；熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司；丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自日本同仁研究所；蛋白提取試劑盒購自武漢純度生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 細胞處理與分組 臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)用DMEM培養液培養，用100 μg/ml的oxLDL處理HUVEC建立細胞損傷模型，作為oxLDL組，正常培養的細胞作為Con組；將pcDNA、pcDNA-circUCK2、anti-miR-NC、anti-miR-483-5p轉染至HUVEC后用100 μg/ml的oxLDL處理，記為oxLDL+pcDNA組、oxLDL+pcDNA-circUCK2組、oxLDL+anti-miR-NC組、oxLDL+anti-miR-483-5p組；將pcDNA-circUCK2分別與miR-NC、miR-483-5p共轉染至HUVEC后用100 μg/ml的oxLDL處理，記為oxLDL+pcDNA-circUCK2+miR-NC組、oxLDL+pcDNA-circUCK2+miR-483-5p組。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測circUCK2和miR-483-5p的表達水平：提取各組內皮細胞的總RNA，反轉錄成cDNA，按照RT-qPCR試劑盒說明進行PCR，擴增條件：95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，40個循環；相對表達量用2-△△Ct法計算。circUCK2和miR-483-5p分別以GAPDH和U6為內參，circUCK2上游引物序列：5’-ACGTGCAGACATCTACAACCT-3’，下游引物序列：5’-TTCTGCTCCGAGGTAAGGAC-3’；GAPDH上游引物序列：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；miR-483-5p上游引物序列：5’-AAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG-3’，下游引物序列：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3.2 試劑盒檢測細胞MDA含量、SOD和GSH-Px活性：細胞培養48 h后，收集各組細胞，按試劑盒說明書進行操作。

1.3.3 流式細胞術檢測內皮細胞凋亡：收集各組細胞，PBS漂洗后按試劑盒說明操作，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.4 蛋白質印跡(Western blot)法檢測蛋白表達：提取細胞總蛋白，定量，每孔上樣40 μg，進行SDS-PAGE，通過濕轉法將蛋白轉至PVDF上，將膜于封閉液中封閉1 h，加Bcl-2、Bax、GAPDH一抗工作液，4℃冰箱中過夜，洗膜后加入二抗孵育2 h，暗室曝光顯影，定影，分析蛋白條帶的灰度值，計算蛋白表達水平。

1.3.5 雙熒光素酶報告實驗：StarBase預測circUCK2與miR-483-5p的結合位點，擴增含結合位點的circUCK2片段，將其插入熒光素酶表達載體中，得到circUCK2野生型載體(WT-circUCK2)，利于基因位點突變技術將circUCK2序列CCCGUCU突變為AUAUGUG，構建circUCK2突變型載體(MUT-circUCK2)，將其分別與miR-483-5p和miR-NC共轉染至內皮細胞中，然后按照說明書檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 circUCK2和miR-483-5p在oxLDL誘導的血管內皮細胞中的表達 與Con組比較，oxLDL組血管內皮細胞中circUCK2表達水平降低，miR-483-5p表達水平升高(P<0.05)。見表1。

2.2 circUCK2過表達對oxLDL誘導的血管內皮細胞

表1 circUCK2和miR-483-5p在oxLDL誘導的血管內皮細胞中的表達

氧化應激的影響 與Con組比較，oxLDL組血管內皮細胞中circUCK2表達水平降低，MDA含量升高，SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05)；與oxLDL+pcDNA組比較，oxLDL+pcDNA-circUCK2組血管內皮細胞中circUCK2表達水平升高，MDA含量降低，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05)。見表2。

表2 circUCK2過表達對oxLDL誘導的血管內皮細胞氧化應激的影響

2.3 circUCK2過表達對oxLDL誘導的血管內皮細胞凋亡的影響 與Con組比較，oxLDL組血管內皮細胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax蛋白表達水平升高(P<0.05)；與oxLDL+pcDNA組比較，oxLDL+pcDNA-circUCK2組血管內皮細胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，Bax蛋白表達水平降低(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 circUCK2過表達對oxLDL誘導的血管內皮細胞凋亡的影響；A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表3 circUCK2過表達對oxLDL誘導的血管內皮細胞凋亡的影響

2.4 circUCK2靶向調控miR-483-5p的表達 StarBase預測發現circUCK2的序列中含有與miR-483-5p互補的核苷酸序列；WT-circUCK2與miR-483-5p共轉染后的血管內皮細胞熒光素酶活性降低，而MUT-circUCK2與miR-483-5p共轉染后的血管內皮細胞熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)。過表達circUCK2后miR-483-5p表達水平降低；抑制circUCK2表達后miR-483-5p表達水平升高(P<0.05)。見圖2，表4、5。

圖2 circUCK2的序列中含有與miR-483-5p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 circUCK2調控miR-483-5p的表達

2.5 抑制miR-483-5p表達對oxLDL誘導的血管內皮細胞氧化應激和細胞凋亡的影響 與oxLDL+anti-miR-NC組比較，oxLDL+anti-miR-483-5p組血管內皮細胞中miR-483-5p表達水平降低，MDA含量降低，SOD、GSH-Px活性升高，細胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，Bax蛋白表達水平降低(P<0.05)。見圖3，表6。

圖3 抑制miR-483-5p表達對oxLDL誘導的血管內皮細胞凋亡的影響;A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表6 抑制miR-483-5p表達對oxLDL誘導的血管內皮細胞氧化應激和細胞凋亡的影響

2.6 上調miR-483-5p表達逆轉了circUCK2過表達對oxLDL誘導的血管內皮細胞氧化應激和細胞凋亡的作用 與oxLDL+pcDNA-circUCK2+miR-NC組比較，oxLDL+pcDNA-circUCK2+miR-483-5p組血管內皮細胞中miR-483-5p表達水平升高，MDA含量升高，SOD、GSH-Px活性降低，細胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax蛋白表達水平升高(P<0.05)。見表7，圖4。

表7 上調miR-483-5p表達逆轉了circUCK2過表達對oxLDL誘導的血管內皮細胞氧化應激和細胞凋亡的作用

3 討論

血管內皮細胞損傷，內皮功能障礙是動脈粥樣硬化的起始環節，其參與動脈粥樣硬化的進展過程；而氧化應激可使細胞氧化損傷，導致細胞凋亡，是血管內皮細胞損傷的重要原因[11,12]。越來越多的證據表明，circRNA與多種心血管疾病的發病機制有關[13]。研究報道沉默circZNF609可在體外保護內皮細胞免于氧化應激和缺氧應激，可改善血管內皮功能障礙[14]。

圖4 上調miR-483-5p表達逆轉了circUCK2過表達對oxLDL誘導的血管內皮細胞凋亡的作用;A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

circHIPK3通過miR-29a/IGF-1途徑調節缺氧處理的心臟微血管內皮細胞的氧化損傷[15]。本實驗結果顯示，oxLDL誘導的血管內皮細胞中circUCK2表達水平降低；過表達circUCK2后，oxLDL誘導的血管內皮細胞中MDA含量降低，SOD、GSH-Px活性升高，細胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，Bax蛋白表達水平降低；表明過表達circUCK2可抑制oxLDL誘導的血管內皮細胞氧化應激和凋亡。

研究報道miR-483-5p可能是冠狀動脈斑塊破裂的潛在生物標志物[16]。miR-483-5p在急性心肌梗死患者心肌組織和低氧誘導的心肌細胞中高表達，過表達miR-483-5p可促進低氧誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激[17]。而miR-483-5p對oxLDL誘導的血管內皮細胞氧化應激和凋亡的影響尚不清楚；本實驗結果顯示，oxLDL誘導的血管內皮細胞中miR-483-5p表達水平升高；抑制miR-483-5p表達，oxLDL誘導的血管內皮細胞中MDA含量降低，SOD、GSH-Px活性升高，細胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，Bax蛋白表達水平降低；表明抑制miR-483-5p表達可抑制oxLDL誘導的血管內皮細胞氧化應激和凋亡。此外,circUCK2靶向調控miR-483-5p；上調miR-483-5p表達逆轉了circUCK2過表達對oxLDL誘導的血管內皮細胞氧化應激和細胞凋亡的作用。

綜上所述，過表達circUCK2可通過靶向下調miR-483-5p抑制oxLDL誘導的血管內皮細胞氧化應激和細胞凋亡。