黑骨藤對脊髓損傷大鼠神經功能恢復的影響及其機制研究*

張 煜，管永濤

（西安國際醫學中心醫院，西安 710100）

脊髓損傷是一種嚴重的創傷性疾病，極大的影響患者的生活質量[1]。基于我國建筑行業、交通事業和旅游戶外行業的快速發展，以及體力活動、慢性損傷、外傷等因素的持續存在，脊髓損傷的發病率呈逐年快速上升趨勢[2]。然而，卻缺乏有效的臨床治療手段，如何有效促進損傷脊髓功能恢復，預防繼發性損傷的出現，是目前研究的重點[3]。黑骨藤為杠柳屬植物黑龍骨的干燥根或全株，既往研究表明，其對修復神經損傷有一定療效[4]。王恒等[5]發現，黑骨藤可改善大鼠坐骨神經損傷，其作用機制與抑制免疫炎癥因子有關。張貴源等[6]發現，黑骨藤能修復線蟲因熱刺激引起的神經損傷。但黑骨藤對脊髓損傷的修復是否有效，目前尚無研究報道。本研究通過建立大鼠脊髓損傷模型，觀察黑骨藤對脊髓損傷和修復的作用，并對其可能機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級健康SD 大鼠30 只，6～8 周齡，體重220～240 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005，使用許可證號：SYXK（滬）2017-0008。所有動物飼養于（20±2）℃恒溫房中，自由進食進水。本研究已通過西安國際醫學中心醫院動物實驗倫理委員會審核批準（批準號：SF201909）。

1.2 藥材和主要試劑 黑骨藤購自貴州同濟堂制藥有限公司。兔抗鼠環氧合酶-2（COX-2）、白細胞介素1β（IL-1β）單克隆抗體、β-actin單克隆抗體和山羊抗兔二抗均購自Epitomics 公司。超氧化物歧化酶（SOD）、誘導性一氧化氮合成酶（iNOS）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒均購自南京化學試劑股份有限公司。

1.3 實驗分組和給藥 將30 只SD 大鼠隨機分為假手術組、脊髓損傷組和黑骨藤組，每組10 只。脊髓損傷組和黑骨藤組采用改良Allen打擊法制備脊髓損傷大鼠模型[7]。術后30 min，黑骨藤組灌胃給予20 mg/kg 黑骨藤，1 次/d，連續10 d。假手術組和脊髓損傷組同時灌胃給予等量生理鹽水。

1.4 脊髓損傷大鼠模型的建立 腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，俯臥位固定于手術臺上，備皮，消毒，鋪巾；取背部正中切口，長約5 cm，逐層分離筋膜、肌肉，充分暴露第9～11 胸椎（T9～T11）椎板后用咬骨鉗咬除，顯露T10節段脊髓；于脊髓表面放置無菌明膠墊，選擇10 g 金屬棒在10 cm 高處自由下落，打擊T10神經節段；停留1 min，挪開金屬棒和明膠墊，縫合傷口。以大鼠痙攣性擺尾、雙下肢及軀體回縮撲動后雙下肢癱瘓為造模成功的標志。術后肌肉注射青霉素（2.5 萬U/kg），連續3 d。假手術組僅暴露脊髓不進行打擊。

1.5 大鼠神經功能評估 分別于術前1 d（t0）及術后1 d（t1）、3 d（t2）、7 d（t3）、21 d（t4），通過斜板試驗和脊髓損傷Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）運動功能評分來評定各組大鼠后肢功能[8]。（1）斜板試驗：將大鼠放置于長方形木板固定位置上，身體縱線與斜板長軸垂直，逐漸抬高斜板一端，密切觀察大鼠，記錄大鼠在斜板上停留5 s 的最大角度，實驗重復5次，取平均值。（2）BBB評分：將大鼠放置于室內寬闊可自由活動地面，自由活動5 min，觀察大鼠行走及髖關節、膝關節、踝關節的協調情況，根據BBB量表[9]進行評分，總分0～21分。BBB評分越高，斜板試驗最大角度越大，表明神經功能越好。斜板試驗和BBB 評分均由兩位不了解實驗分組但掌握評分標準的人員進行操作。

1.5 蘇木精-伊紅（HE）染色 術后第28天處死大鼠，快速取出脊髓，取左側距離矢狀中線1.0 cm 處脊髓組織制作石蠟切片，行HE染色，中性樹膠封片后，光學顯微鏡下觀察脊髓組織病理變化。

1.6 脊髓組織iNOS、NO、SOD和MDA濃度檢測 取損傷段脊髓，低溫勻漿，3 500 r/min 離心20 min，取上清液，采用ELISA 法檢測脊髓組織iNOS、NO、SOD 和MDA 濃度。檢測過程嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.7 Western blotting 法檢測COX-2 和IL-1β 蛋白表達 取損傷段脊髓，加入RIPA裂解液，冰上研磨10 min，4 ℃下高速離心15 min，取上清，BCA 法測定蛋白濃度；加入上樣緩沖液混合后煮沸5 min 使蛋白變性，10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF 膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗膜，加入一抗COX-2（1∶3 000）、IL-1β（1∶3 000）、β-actin（1∶5 000）4 ℃冰箱孵育過夜；洗膜，加入山羊抗兔二抗（1∶4 000）室溫下搖床孵育1 h，ECL顯影，凝膠成像系統掃描、拍照。用Image J軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白與內參β-actin 蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.8 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組神經功能比較 脊髓損傷組和黑骨藤組大鼠在t1～t4 時間點斜板試驗最大角度和BBB 評分均明顯低于假手術組同一時間點，脊髓損傷組大鼠在t3～t4 時間點斜板試驗最大角度和BBB 評分均明顯低于黑骨藤組同一時間點（均P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠斜板試驗最大角度和BBB評分比較

表1 各組大鼠斜板試驗最大角度和BBB評分比較

與本組t0 時間點比較，*P＜0.05；與假手術組同一時間點比較，#P＜0.05；與脊髓損傷組同一時間點比較，△P＜0.05。

2.2 各組脊髓組織病理形態改變 HE染色顯示，假手術組脊髓未見破壞征象，細胞分布規律，脊髓結構完整，灰白質界限清楚，灰質內神經元形態正常；脊髓損傷組脊髓組織結構被破壞，脊髓細胞排列混亂，灰白質界限不清，大量星形膠質細胞增生，有巨大的中央空洞形成；黑骨藤組脊髓組織破壞程度明顯減輕，脊髓壞死空洞范圍縮小，灰白質結構尚清，灰質內見少量神經元，見圖1。

圖1 各組大鼠脊髓組織HE染色圖（×200）

2.3 各組脊髓組織iNOS、NO、SOD和MDA水平比較 與假手術組比較，脊髓損傷組MDA、NO和iNOS 含量均顯著升高，而SOD 活性降低（均P＜0.05）；黑骨藤組MDA、NO和iNOS含量均較脊髓損傷組降低，SOD活性升高（均P＜0.05），見表2。

表2 各組脊髓組織iNOS、NO、SOD和MDA水平比較

表2 各組脊髓組織iNOS、NO、SOD和MDA水平比較

與假手術組比較，*P＜0.05；與脊髓損傷組比較，#P＜0.05。

2.4 各組脊髓組織COX-2和IL-1β蛋白表達比較 與假手術組比較，脊髓損傷組和黑骨藤組COX-2 和IL-1β 蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）；與脊髓損傷組比較，黑骨藤組COX-2 和IL-1β 蛋白表達量明顯降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 3組脊髓組織COX-2和IL-1β蛋白表達比較

3 討論

本組預實驗分別用10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg黑骨藤灌胃，發現20 mg/kg黑骨藤具有最好的療效和最低的副作用，因此，本研究選擇20 mg/kg 劑量的黑骨藤進行實驗。結果顯示，與假手術組比較，脊髓損傷組斜板實驗最大角度和BBB評分均明顯下降（P＜0.05），提示大鼠神經功能受損，手術造模成功；與脊髓損傷組比較，黑骨藤組斜板實驗最大角度和BBB 評分均有明顯提升（P＜0.05），說明黑骨藤可減輕大鼠脊髓損傷程度，對大鼠的運動功能具有改善作用。本研究HE 染色發現，黑骨藤干預后脊髓損傷大鼠的脊髓組織壞死情況明顯改善，脊髓壞死空洞范圍縮小，進一步表明黑骨藤可減輕大鼠的脊髓損傷程度。

脊髓損傷的病理過程包括原發性機械損傷和繼發性損傷兩個階段，因原發性機械損傷無法干預[10-11]，因此，改善脊髓損傷患者的預后，研究重點為試圖減輕繼發性損傷[12]。常見的繼發性損傷因素包括局部血流的改變、氧化應激、炎癥和興奮性毒性等[13]。其中氧化應激是機體的基本保護機制之一，參與神經細胞信號轉導等活動的調節[14]。劉康等[15]研究發現，維生素B6通過減輕脊髓損傷大鼠的氧化應激反應，從而改善神經功能的恢復。為了闡明黑骨藤對脊髓損傷大鼠氧化應激的影響，本研究評估脊髓組織氧化應激相關指標MDA和SOD水平變化。結果顯示，與假手術組比較，脊髓損傷組脊髓組織MDA 含量升高，SOD 活性降低（P＜0.05），說明大鼠脊髓損傷后出現氧化應激損傷；與脊髓損傷組比較，黑骨藤組脊髓組織MDA含量降低，SOD活性升高（P＜0.05）。說明黑骨藤可通過抑制脊髓損傷后氧化應激從而發揮神經保護作用，這可能是黑骨藤改善脊髓損傷大鼠神經功能的重要機制。

炎癥反應在脊髓損傷中起關鍵作用，局部損傷組織的炎癥反應可增加脊髓損傷的繼發性損害程度[16]。作為促炎細胞因子，IL-1β和IL-6在炎癥反應的啟動中具有重要作用[17]。有研究表明，通過減少促炎細胞因子水平可減輕組織損傷的加劇[18]。NO和iNOS 對神經系統損傷至關重要[19]。在生理情況下iNOS基本不表達，而在神經細胞遭受創傷后，受損部位持續缺血缺氧引起促炎癥細胞因子的釋放，進而誘導iNOS基因的轉錄使其生成增加。本研究中，與假手術組比較，脊髓損傷組脊髓組織IL-1β和COX-2 蛋白表達水平升高，同時，iNOS 和NO 水平升高，而黑骨藤組脊髓組織IL-1β、COX-2、iNOS 和NO 水平均較脊髓損傷組明顯降低（P＜0.05），說明黑骨藤可通過抑制脊髓損傷后炎癥反應和iNOS表達從而發揮神經保護作用。

綜上所述，黑骨藤對脊髓損傷大鼠具有顯著的神經保護作用，改善大鼠運動功能，其機制可能與抑制氧化應激反應和炎癥反應及減少iNOS 和NO生成有關。