基于氨基酸評估測定嬰幼兒配方乳粉中蛋白質水解度

◎ 黃偉乾，霍玟希，盤志琪，練浩宏，許麗珠，黃榮榮，鄭學殷

（廣州檢驗檢測認證集團有限公司 國家加工食品質量檢驗中心（廣東），廣東 廣州 511447）

蛋白質是由不同氨基酸按一定順序通過肽鍵連接而成的肽構成的。氨基酸序列就是蛋白質的一級結構，它決定著蛋白質的空間結構和生物功能。蛋白質分為完整蛋白和不完整蛋白，蛋白質徹底水解的產物為各種氨基酸，部分水解的產物為各種大小不等的肽段和氨基酸。蛋白質的常用的水解方式包括酸水解法[1-2]、堿水解法、酶水解法[3]。蛋白質水解有利人體營養的吸收，通過蛋白質水解，水解為二肽或三肽的產物在人體內比自由氨基酸和未水解的蛋白質更易于吸收；對嬰幼兒配方乳粉[4]進行適度水解或在配料中添加適量的水解乳清蛋白粉，可降低致敏性，幫助嬰幼兒更好地吸收。特殊醫學用配方食品[5-7]中也提到適度水解配方和深度水解配方，對特殊嬰兒群體具有適用性。

水解蛋白產物對產品的影響主要包括以下方面。①營養基本不變，水解蛋白的吸收更容易。大部分蛋白質需在十二指腸和空腸內經蛋白水解酶進行初步消化，最后是在小腸腸腔內消化完成，部分短肽能直接被吸收。②水解蛋白降低嬰幼兒對乳蛋白的致敏性[8-9]。食物蛋白過敏是嬰兒對食物中蛋白質不恰當的免疫應答引起的不良反應。嬰兒早期食物以乳類為主，乳蛋白水解是通過一定工藝將易引起過敏反應的大分子乳蛋白水解成短肽[10-12]及游離氨基酸。嬰兒食物蛋白過敏時通常伴有腹瀉等癥狀，乳蛋白水解減少或消除了食物蛋白的形態，以減少對嬰兒胃腸道的刺激。③乳蛋白水解后，乳粉的溶解度更高，水解蛋白的風味由原有的乳香味變成氨基酸和肽的特殊風味，同時也增加了氨基酸的鮮味和苦味。

嬰幼兒配方乳粉[13]中蛋白質的水解度[14-16]主要來源有3種。①采用水解工藝進行嬰幼兒配方奶粉的生產。②乳中天然的蛋白酶在生產過程中發生酶解作用。③通過將原料水解、提純后，作為嬰幼兒奶粉生產的原料。

目前報道的檢測水解度的主要方法有TNBS法[15]、OPA法、茚三酮比色法、甲醛滴定法[16]等。蛋白質的水解度一般是指蛋白質被催化水解時所裂解的肽鍵數目[14]，占蛋白質分子中總肽鍵的比例，但蛋白質的肽鍵數目無法用常規方法進行計算或檢測得出，且蛋白質容易存在水解不徹底的情況，以致無法完全水解成游離氨基酸，導致計算存在偏差。目前，基于氨基酸進行評估蛋白質水解度的報道較少[14,17]。

高分子蛋白質在酸性條件下易被沉淀，相對分子質量較小的的蛋白水解物（如游離氨基酸）可溶于酸性溶液中（如三氯乙酸溶液）。本研究基于采用氨基酸分析/離子交換分離技術檢測18種游離氨基酸，再通過容量法檢測蛋白氮含量，可計算出水解度。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

S-433D氨基酸分析儀（Sykam公司），8420自動凱氏定氮儀（Foss公司），Milli-Q去離子水發生器（Millipore公司），MS204T分析天平（梅特勒公司），3-30K高速離心機（Sigma公司），KDC-1044低速離心機（中佳公司）。

1.2 材料與試劑

氨基酸混合標準溶液（16種）、L-半胱氨酸、L-色氨酸均購自安譜公司；三氯乙酸、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、磺基水楊酸、鹽酸、檸檬酸鈉和維生素C均為AR級，廣州化學試劑廠；茚三酮、鉀鈉緩沖液購于Sykam公司；乙腈、三氟乙酸均為色譜純，Thermo fisher公司；去離子水（＞18.0 MΩ·cm），由Milli-Q純水系統制備。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白質氮含量的測定

稱取約0.5 g（精確至0.1 mg）樣品，經硫酸消解，再經自動凱氏定氮儀堿性蒸餾，確定蛋白質中的氮含量[18]。

1.3.2 氨基酸（18種）氮含量的測定

（1）標準溶液配制。①L-半胱氨酸標準溶液。分別稱取標準品12.1 mg，用pH=2.2檸檬酸鹽緩沖液解定容于50.0 mL容量瓶中，配制成2.0 μmol·mL-1標準溶液，置于4 ℃下可保存1個月。②L-色氨酸標準溶液。分別稱取標準品20.4 mg，用0.05 mol·L-1NaOH溶液定容于50.0 mL容量瓶中，配制成2.0 μmol·mL-1標準溶液，置于4 ℃下可保存1個月。③混合18種氨基酸標準工作溶液。移取16種混合氨基酸標準溶液100 μL，L-半胱氨酸和L-色氨酸標準溶液各250 μL于10 mL容量瓶中，用pH=2.2檸檬酸鹽緩沖液定容，配制成0.025 nmol·mL-1標準溶液（現配配用）。

（2）氨基酸分析色譜條件。磺酸型鈉離子分離柱，柱溫：57 ℃，反應器溫度：135 ℃，流動相流速：0.45 mL·min-1，衍生液流速：0.25 mL·min-1，梯度洗脫見表1。檢測器波長：570 nm和440 nm；進樣量50 μL，以單點標準進行定量。

（3）前處理方法。移取樣品約2 g于100 mL容量瓶中，加約50 mL約50 ℃溫水渦旋振蕩溶解，超聲10 min充分溶解，冷卻后加入5 mL 15%三氯乙酸溶液，加水定容。分取少量樣液于15 000 r·min-1高速離心5 min，取上清液過0.22 μm尼龍濾膜，待分析。

1.3.3 蛋白水解度的計算

蛋白水解度按以下公式計算：

式中：mx為儀器軟件上填寫稱樣量及定容體積即可自動算出樣品中各氨基酸質量，mg；m為樣品稱樣量，g；N為各種氨基酸的理論含氮量，%；NT為蛋白質的氮含量，%。

2 結果與分析

2.1 游離氨基酸（18種）前處理方式的確定

實驗考察了15%三氯乙酸溶液、3.5%磺基水楊酸、鹽酸調pH值至4.5（蛋白質的等電點）共3種前處理方式對色譜分離的影響，分析圖譜（570 nm）見圖1～3。結果表明：使用磺基水楊酸沉淀處理和三氯乙酸沉淀處理的分離效果較好，干擾較少，且保留時間較穩定，本研究優先選擇三氯乙酸前處理。

圖1 三氯乙酸前處理圖

2.2 色譜條件的確定

經優化，通過調整淋洗的梯度，淋洗梯度見表1，18種氨基酸分離較好，標準圖譜見圖4～5。

圖4 18種氨基酸標準圖（570 nm）

表1 梯度洗脫程序表

2.3 氨基酸的回收率、精密度試驗

本研究在三氯乙酸沉淀處理下進行回收率試驗。同時選取中間添加水平，連續測試4次，計算精密度，實驗結果詳見表2。18種氨基酸在0.05～0.50 μmol·g-1加標水平下，回收率在90.8%～108.2%，相對標準偏差（n=4）為0.8%～3.7%，表明方法具有良好的回收率和精密度，可滿足嬰幼兒配方奶粉中18種游離氨基酸的測定要求。

表2 18種氨基酸的回收率和精密度測定結果表（n=4）

圖2 磺基水楊酸前處理圖

圖3 鹽酸調pH=4.5前處理圖

圖5 脯氨酸標準圖（440 nm）

2.4 實際乳粉樣品蛋白質水解度的檢測

在廣州本地市場隨機購買了16份樣品，按本檢測方案進行水解度的檢測，結果詳見表3。結果顯示，大部分樣品的蛋白質水解度較低，經核對配料表發現少部分樣品添加了氨基酸單體或水解乳清蛋白粉，還發現標識上標注生產過程中采用了乳蛋白水解工藝進行適度處理。嬰幼兒配方乳粉樣品中氨基酸占比越高，則表明蛋白質的水解程度越大，水解度就越高。

表3 16份實際樣品檢測結果表

3 結論

本文建立了基于18種氨基酸氮含量評估嬰幼兒配方乳粉中蛋白質水解度檢測方法，方法采用容量法、氨基酸分析法相結合，測定水解度的方法學評價表明該方法的回收率和精密度良好。該方法前處理簡單，可用于嬰幼兒配方乳粉蛋白質水解度的測定。