市政排水管網水力水質條件對底泥微生物組多樣性的影響

丁國平，陳 浩，朱 弈，孫曉楠，劉 輝，馬長文，葉建鋒*

1. 上海第二工業大學工學部，上海 201209

2. 上海市環境科學研究院，上海 200233

3. 東華大學環境科學與工程學院，上海 201620

市政重力流排水管網中存在著較大的碳排放現象，污水和雨水中大量有機物在管網輸送過程中被微生物降解消耗[1]，這直接導致了下游污水廠普遍出現進水碳源不足的現象[2-3]. Mclellan等[4]認為，管網底泥中的微生物是其碳轉化的重要執行者，多樣的微生物利用管網缺氧環境對有機物進行水解發酵、產甲烷、硫酸鹽還原，并完成自身菌體的繁殖生長與代謝.因此，研究重力流管網中底泥微生物菌群結構的變化規律具有重要意義.

目前對城市排水系統底泥微生物多樣性的研究多集中于污水處理廠和河道，且其均受不同水力水質條件的影響. 而重力流排水管網內水力水質條件的變化是否會影響底泥微生物組的多樣性，進而影響微生物碳轉化的策略與效率，卻鮮見報道. 污水處理廠和河道的底泥微生物通過選擇性地消耗特定的底物，進行不同的生長和碳分配，其底物的性質受化學因素(如pH、不同碳的來源、SO42-濃度等)影響. 另外，一些物理因素(如溫度、剪切力等)大多會通過影響有機物組成和微生物群落狀態，造成碳轉化的差異. 例如，已有研究發現，河流pH的變化可以引起藻細胞膜電荷的變化以及影響代謝過程中酶的活性[5]，當pH為10時，對細菌群落產生更多的揮發性脂肪酸(VFA)有緩沖作用[6]；Schulz等[7]研究發現，康斯坦斯湖底泥中溫度每升高10 ℃，細菌代謝速率將增加2~3倍，這表明溫度是影響微生物細胞內某些酶活性的重要因素，進而影響微生物的生長速率和微生物對基質的代謝速率；Liu等[8]對高海拔湖泊有機物的研究發現，較大的剪切力有利于促進有機物在底泥中的滲透，對碳的轉化效率有顯著的影響. 不同碳源可能會影響微生物的豐度，在污水處理廠相似的污染進水源中，微生物群落具有相似性[9]，而不同的進水源會影響活性污泥菌群組成和多樣性[10]. 盡管早在1992年就有少數研究團隊已經注意到了重力流管網底泥中的一些生物行為[11]，但對底泥生物的研究卻主要集中在生物作用下底泥的形成過程和管道腐蝕等方面[12-13]，很少有研究致力于不同水力水質工況對底泥微生物多樣性變化的影響.

該研究通過控制上覆水的剪切力、溫度、SO42-、pH、外源性碳這5個水質水力工況進行批次試驗，應用微生物16S rRNA基因測序分析方法，對微生物的相對豐度、多樣性結構和微生物組間差異顯著性檢驗進行分析，并結合三維熒光光譜法(EEM)以及底泥COD降幅，探究不同環境因子對底泥中微生物組多樣性的影響，以期通過控制水力水質工況減少市政重力流排水管網中微生物碳轉化的現象.

1 材料與方法

1.1 采樣點布設

該研究所用污水和雨水管網底泥分別于旱季采自上海某排水系統a、b管網. 其中a管網為生活小區污水管支管，承接完全的生活污水. 徑流雨水采自b管網沿管雨水篦，為完全的路面雨水徑流. 底泥于旱季采集自c、d、e管網. 生活污水、徑流雨水和初始底泥間隙水經0.22 μm聚醚砜濾膜后，測定其COD、TN和SO4

2-濃度(見表1).

表 1 初始水樣和底泥中的指標濃度Table 1 Index concentration in initial water sample and sediment

1.2 批次試驗

為模擬重力流排水管道內黑暗厭氧環境和泥液分層的環境，該研究采用文獻[14]的設計理念，設計了直徑為140 mm、高度為210 mm反應器(見圖1).該反應器上部密封蓋設有氣體出入口、水樣采集口、溫度計和攪拌器. 試驗前先將底泥用0.4 mm篩濾去石頭、樹枝等大型固體物，再將0.6 L底泥和2.3 L上覆水置入反應器中. 待泥水分層后(約4 h)，用錫紙包裹住反應器表面，模擬黑暗環境，引入氮氣以保持頂空厭氧，并控制攪拌器轉速來調整水力剪切力. 同時，依據底泥微生物生長周期(約為6 d[15])及上海重力流排水管網水力停留時間(旱季為4~6 d)，設定反應時間為6 d. 最后取上覆水和泥水交互界面的上層底泥進行16S rRNA基因測序分析.

圖 1 市政重力流排水管網模擬反應器示意Fig.1 Schematic diagram of simulated reactor for municipal gravity flow drainage pipe network

為模擬不同水力水質工況，該研究進行批次試驗. 其中，為避免雨污水中微生物對底泥中微生物多樣性的影響，所有的雨污水樣本均通過0.22 μm聚醚砜濾膜，濾去絕大多數的微生物. 因不同碳源試驗組的需要，分別設計以超純水、在超純水中添加葡萄糖(≥99.5%)、徑流雨水以及生活污水為上覆水的試驗組，其超純水和葡萄糖源水水質指標見表1；設計烘干污泥，以研究滅活了絕大部分微生物活性的底泥與不同碳源的上覆水在反應后微生物的變化情況. 此外，不同轉速對應不同的剪切力，其剪切力計算方法根據Blasius方程計算. 批次試驗設計及樣本編號如表2所示.

表 2 模擬重力流排水管網批次試驗的設計Table 2 Batch experimental design of simulated gravity drainage pipe network

1.3 化學分析

上覆水及底泥的化學指標包括COD、TN、SO42-.底泥的化學指標定義為其間隙水的化學指標，通過將底泥在8 000 r/min下離心，取上清液獲得. 根據國家標準方法測定上覆水和間隙水中TN、COD和SO42-的濃度.

結合熒光光譜(EEM)(F-7 100，日本日立公司)分析上覆水和底泥中DOM的組成. 反應前生活污水中主要為色氨酸類有機物(λEx/λEm=270~290 nm/320~350 nm)，其多為氨基酸類、肽類及蛋白類物質，一般為新近產生[16]. 徑流雨水中主要為腐殖酸及難降解腐殖酸成分(λEx/λEm≤250 nm/380 nm)，但微生物對這些成分的轉化效率并不高[17]. 因此在控制變量的條件下，通過分析底泥中類色氨酸熒光強度峰值的變化，判斷沉積物中的微生物對碳轉化效率的不同. 該研究底泥樣本中類色氨酸熒光強度峰值見表3.

表 3 底泥樣本中類色氨酸熒光強度峰值Table 3 Kurtosis value of tryptophan-like in sediment sample

1.4 微生物16S rRNA基因相對定量測序與分析方法

試驗前取約20 mL管網底泥或1 L污水，污水過0.22 μm Whatman GF/F濾膜，至膜上有明顯覆蓋物后裝于離心管，-20 ℃保存(并在一周內測定)，用于基因組DNA提取. DNA 提取采用試劑盒Fast DNA Spin Kit (MP bio)，提取后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測. 采用PCR儀(ABI GeneAmp?9700，Applied Biosystems，德國)進行PCR擴增. 參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)進行檢測定量，IlluminaMiSeq測序后以silva123/16s_bacteria數據庫進行分類學分析[18].

結合微生物的Alpha多樣性分析，利用Shannon-Wiener、Simpson、Chao 1和Coverage指數估計環境群落的物種豐度和多樣性；用微生物的Beta多樣性對底泥微生物群落間的物種多樣性進行組間相對定量比較分析. 同時，通過Wilcox秩和檢驗對組間微生物進行差異顯著性分析，判斷兩樣本中微生物的分布是否存在差異，并通過P值判斷其顯著性.

2 結果與討論

2.1 微生物Alpha和Beta多樣性分析

該研究基于OTU水平，進行Alpha多樣性分析，繪出Shannon-Wiener曲線〔見圖2(a)〕，曲線坡度隨測序深度增加趨于平坦，測序數量足夠大，可反映測序樣本微生物種群多樣性的真實情況. 在16S rRNA測序中共得到651 958條有效序列和28 516個OTUs數. OTUs數以及物種多樣性如表4所示.

表 4 細菌多樣性指數分析Table 4 Bacterial diversity index analysis

圖 2 初始底泥微生物的Alpha和Beta多樣性分析Fig.2 Analysis of Alpha and Beta diversity of microorganisms in initial sediment

根據OTUs數以及物種多樣性(見表4)可知：不同外源性碳組中，A1_EU微生物群落相對豐度和多樣性較反應前降低；A2_EU微生物群落相對豐度和多樣性相對A1_EU增大；A3_EU微生物群落多樣性低于A4_EU. 此外，B4_EU微生物群落相對豐度和群落多樣性均低于B5_EU. 剪切力組中，B1_EU微生物群落多樣性略低于B5_EU，且B1_EU微生物群落相對豐度更為明顯較低. 溫度組中，B2_EU和B5_EU微生物群落多樣性相似，但B2_EU微生物群落相對豐度較低. pH組中，B3_EU微生物群落多樣性略低于B5_EU，但B3_EU微生物群落相對豐度顯著較低.SO42-組中，C2_EU微生物群落多樣性和相對豐度與C1_EU相似，但上覆水中C2_ES微生物群落多樣性和相對豐度遠低于C1_ES.

通過Beta多樣性分析可知，底泥1#、2#、3#〔見圖2(b)〕微生物在門水平上的優勢種主要為Proteobacteria (變 形 菌 門，占 比 為29% ~ 37%)、Bacteroidetes (擬 桿 菌 門，占 比 為24% ~ 39%)、Chloroflexi (綠 彎 菌 門，占 比 為28% ~ 41%)、Firmicutes (厚壁菌門，占比為26% ~ 38%)等. 其中，Proteobacteria、Bacteroidetes及Firmicutes作為管網底泥在門水平上的優勢種，是厭氧消化系統中最為重要的發酵菌門[19]，可見排水管網內的生化反應過程以發酵作用為主.

屬水平上優勢種主要為Candidatus_Competibacter(聚 糖 菌 屬，占 比 為 6.5%~8.0%)、norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17(無分類_擬桿菌門屬，占比為4.0%~8.6%)、Defluviicoccus(占 比 為4.7%~3.2%)、Dechloromonas(脫 氯 單 胞 菌, 占 比 為2.8%~5.0%)、vadinBC27_wastewater-sludge_group( 占比為1.1% ~4.9%)等〔見圖2(c)〕. 其中，Candidatus_Competibacter在管網厭氧過程中產生并積累聚-β羥基-鏈烷酸酯(PHA)，再以硝酸鹽和亞硝酸鹽作為電子受體在缺氧段還原PHA，隨后在好氧條件下可以將聚羥基脂肪酸氧化成二氧化碳或轉化成糖原[20]；norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17是一種厭氧桿菌，可分解蛋白胨或葡萄糖，產生乙酸、乳酸和丙酸等[21]，與Candidatus_Accumulibacter類似，具有PHA與脂肪酸合成功能[22]，是降解管網中有機碳的重要菌屬.

2.2 不同水力水質工況對微生物組多樣性的影響

2.2.1外源性碳

在外源性碳的影響下，通過門水平的相對豐度分析〔見圖3(a)〕可知，A1_EU中僅有Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes，而A2_EU除這三類細菌門外，還發現相對豐度較低的Actinobacteria(放線菌門，0.38%)、Synergistetes(互養菌門，0.5%)和Spirochaetae(螺旋菌門，0.4%). 烘干底泥在沒有外源性碳源和微生物補充的情況下，原底泥中vadinBC27_wastewater-sludge_group、norank_c__Bacteroidetes_vadinHA17等厭氧消化的菌屬幾乎消失. 而過膜后的污水雖濾去大多微生物，但仍留有大量溶解性有機物，為底泥補充了適量的碳源，因此A2_EU中厭氧發酵菌豐度得到提高，出現Synergistete、Spirochaetae等產甲烷階段的新增菌群. 對A3_EU和A4_EU進行屬水平的組間差異性分析〔見圖3(b)〕，發現優勢菌屬在有外源性碳補充的底泥中相對豐度更高，其中厭氧桿菌norank_c__Bacteroidetes_vadinHA17差異性最顯著(P≤0.001)，在樣本中相對豐度分別為7.6%和11.7%.

此外，徑流雨水和生活污水中因所攜帶的有機物種類不同，使得微生物對其作用效率不同，所以不同的外源性碳對底泥中微生物組的多樣性也有影響. 通過對B4_EU和B5_EU中微生物的門水平組間差異性分析〔見圖3(c)〕，優勢菌門均為Bacteroidetes、Chloroflexi、Firmicutes、Acinetobacter等有機物降解類相關菌門，但在污水組底泥中相對豐度更高.Bacteroidetes能分解底泥中蛋白胨或葡萄糖，產生乙酸、乳酸和丙酸等；Chloroflexi作為一種嚴格的厭氧微生物，能利用一系列的短鏈脂肪酸產生H2、CO2及乙酸，并且能與氫營養的產甲烷菌共生參與有機化合物的降解；Firmicutes可以水解蛋白、脂肪和碳水化合物等大分子物質，在厭氧發酵過程中對揮發酸的產生具有重要作用. 這些優勢菌門可快速分解底泥中部分蛋白質及有機酸等簡單小分子物質，完成自身的微生物呼吸及代謝過程[23]，因此這些優勢菌門在得到污水中大量有機物的補充后，相對豐度顯著高于雨水組(0.01＜P≤0.05). 同時通過EEM分析，反應后污水組底泥中類色氨酸熒光峰強度較反應前的增幅(142.7%)大于雨水組(72.6%)(見表3)，可側面證明污水組底泥中有機物降解類微生物相對豐度更高，微生物作用產物更多.

2.2.2剪切力

不同剪切力對底泥表層生物環境和微生物群落結構影響較大. 剪切力的增大有利于DOM在底泥中的滲透，促進底泥中微生物的生長和碳降解效率. 基于門水平下剪切力組底泥微生物的組間差異性〔見圖4(a)〕，發現Proteobacteria和Chloroflexi在B5_EU中相對豐度分別為44.4%和8.9%，在B1_EU中相對豐度分別為46.5%和10.9%，呈顯著性差異(P≤0.001)，因此反應后較高剪切力組的底泥COD降幅(81.1%)大于對照組(74.0%)〔見圖4(c)〕，且反應后類色氨酸熒光強度的增幅(294.2%)高于對照組(142.7%)(見表3).

圖 3 外源碳組底泥微生物的群落分析和組間差異性分析Fig.3 Analysis of sediment microbial community and inter-group difference in exogenous carbon group

圖 4 剪切力組底泥微生物的組間差異性分析和COD濃度變化趨勢Fig.4 Analysis of the difference between microbial groups in the sediment of shear stress group and the change trend of COD concentration

剪切力一方面影響了上覆水中碳源向底泥的滲透，另一方面造成水流湍動加大溶解氧逸散. 基于屬水平下剪切力組底泥微生物的組間差異性〔見圖4(b)〕，發現優勢菌屬Dechloromona、norank_f_Anaerolineaceae(厭氧繩菌屬)、Longilinea(長繩菌屬)在B1_EU中相對豐度顯著(P≤0.001)高于B5_EU中的相對豐度，其在B1_EU相對豐度分別為5.5%、2.3%和2.8%，而在B5_EU中的相對豐度分別為4.3%、2.3%和1.5%. 因此高剪切力為這些主要功能是分解蛋白、碳水化合物的底泥厭氧微生物提供了良好的厭氧環境，使厭氧類微生物的豐度增加. 此外，低剪切力下可富集更多微生物，形成緊密的活性高的生物膜[24]，0.732 N/m2的剪切力可能影響了管網中泥水分層的界面，破壞了上層底泥的環境，因此使得微生物群落多樣性降低.

2.2.3溫度

在不同溫度的影響下，底泥中主要優勢菌門Proteobacteria、Bacteroidetes和Chloroflexi的相對豐度〔見圖5(a)〕均呈現顯著性差異(P≤0.001). 因溫度會影響微生物蛋白質活性，同時較高溫度會降低底泥中溶解氧濃度，所以在25 ℃環境下，B5_EU中Proteobacteria、Bacteroidetes等菌門相對豐度更高；而Chloroflexi(11.1%)可適應溫度較廣，可在41 ℃環境下的底泥中進行厭氧反應，所以在B2_EU中相對豐度更高. 結合EEM分析，B5_EU中類色氨酸熒光強度的增幅(142.7%)高于對照組(94.6%)(見表3)，可側面證明25 ℃環境中微生物組相對豐度更大，微生物作用產物更多.

從屬水平〔見圖5(b)〕分析，優勢菌屬Candidatus_Competibacter、Defluviicoccus等相對豐度較高且呈顯著性差異(P≤0.001)，且在B2_EU中相對豐度更高(分別為4.9%和3.8%).Defluviicoccus適宜溫度較高，在厭氧階段吸收并儲存糖類有機物，為厭氧代謝提供能源[25]；Candidatus_Competibacter的厭氧最適溫度為35 ℃左右，合成PHA的速率隨溫度的升高而降低，而好氧溫度最高不超過30 ℃，因此相比于25 ℃，41 ℃更有利于Candidatus_Competibacter生存.

圖 5 溫度組底泥微生物的組間差異性分析Fig.5 Analysis on the differences of the bottom mud microorganisms of the temperature group

2.2.4pH

微生物生長有最適的pH范圍，不同的pH會改變營養物質的供給狀態，影響菌體細胞膜的帶電荷性質和穩定性，還會影響對物質的吸收能力，最終影響微生物群落和豐度.

通過門水平的組間差異分析〔見圖6(a)〕可知，只有優勢菌門Proteobacteria、Chloroflexi在B3_EU中的相對豐度分別為49.4%和10.1%，顯著(P≤0.001)大于在B5_EU中的相對豐度(分別為44.4%和8.9%).在B3_EU的堿性環境中，這兩個優勢菌門均為桿狀菌，沒有過量的絲狀菌，這與朱哲等[26]研究結果一致.而其余呈顯著性差異的優勢菌門(P≤0.001)在B5_EU中相對豐度更高，如Bacteroidetes、Firmicutes等. 這些細菌因胞外聚合物多帶負電荷，在堿性環境下，胞外聚合物中酸性基團發生了裂解，使多糖和蛋白質流出[27]，且優勢種在有充足碳源的情況下產生并積累有機酸，使B3_EU的COD降幅(75.7%)低于B5_EU的COD降幅(54.6%)〔見圖6(b)〕. 這與黃健等[28]研究在堿性環境下，大量細胞裂解和累積的有機酸，使得類色氨酸熒光強度的增幅(201.5%)高于中性環境下的(142.7%)(見表3)的結果一致，因此B3_EU中微生物的相對豐度較低，但微生物種類卻略少于B5_EU中的微生物種類.

圖 6 pH組底泥微生物的組間差異性分析和COD濃度的變化趨勢Fig.6 Analysis of difference between microflora and change trend of COD concentration in sediment of pH group

2.2.5SO42-濃度

在不同SO42-條件下，C1_EU和C2_EU中微生物群落相似且相對豐度變化不明顯，但上覆水中微生物組成和相對豐度變化明顯，且屬水平組間差異顯著(見圖7)，優勢種主要為Zavarzinia(扎瓦爾金氏菌屬)、Methyloparacoccus和Kerstersia(克斯特菌屬). C2_ES中Zavarzinia(25.9%)、Methyloparacoccus(30.5%)、Kerstersia(18.4%)相對豐度均大于C1_ES中的相對豐度(依次分別為12.6%、2.3%和7.5%). 同樣作為上覆水優勢種的Methylocystis(甲基孢囊菌屬)也呈顯著性差異(P≤0.001)，但C1_ES的Methylocystis(10.7%)的相對豐度遠大于C2_ES中的相對豐度(3.2%). 這是因為高SO42-濃度為嗜酸菌、酸桿菌、硫酸鹽還原菌等菌屬提供了良好的生存環境，對厭氧反應類的微生物有較大抑制性. 但改變SO42-濃度對底泥中微生物影響不大，這不僅是因為SO42-滲透有限，也是因為產硫過程只發生在底泥表面0~1 cm處[2]. 同時，Methylocystis和其他噬酸甲烷氧化菌一樣，無法在有機酸或糖中生長[29]，能夠利用甲烷和甲醇，又能夠利用一些含C-C鍵的多碳有機物作為其生長底物[30].

上覆水SO42-濃度對上覆水中微生物產生了較大的影響，尤其高濃度的SO42-會對厭氧微生物產生強烈的抑制作用，且SO42-濃度越大，厭氧發酵氣體產排量越低，這與Jeong等[31]研究甲烷菌在含SO42-污泥中受抑制的結果一致. 上覆水中優勢菌Zavarzinia，對酸性條件有較高的耐受能力，可在pH小于5的酸性環境中生長. 新鮮的徑流雨水含大量的溶解氧，且SO42-濃度為72 mg/L，這為嚴格好氧的優勢種Zavarzinia提供了良好的生存環境. 大量Zavarzinia將乙醇氧化成醋酸，減少了碳的轉化. 同樣是優勢種且適宜生存在酸性和有溶解氧環境中的Methyloparacoccus，可利用CH4或甲醇這類C1化合物作為其生長底物[32]，直接或間接地減少CH4的產生.

3 結論

a) 市政重力流排水管網底泥中優勢菌門Bacteroidetes、Chloroflexi、Firmicutes、Acinetobacter等均為有機物降解類細菌. 當混接的污染源越多，類色氨酸類有機物就越多，細菌群落多樣性就越高；當 外 源 性 碳 濃 度 越 高，Bacteroidetes、Chloroflexi、Firmicutes、Acinetobacter等菌門豐度就越高. 因此整治管網混接，實行分流制排水系統，有利于控制底泥微生物的多樣性，減少碳的轉化.

b) 在一定范圍內，剪切力越高，底泥中Dechloromona、norank_f_Anaerolineaceae、Longilinea等厭氧微生物(其主要功能是分解蛋白、碳水化合物)的豐度就越高. 而過高的剪切力，可能會破壞泥水分界面，減少生物膜的形成，降低微生物群落的多樣性.

c) 在一定范圍內，溫度越高，底泥微生物組豐度就越高. 在41 ℃環境下，適應溫度較廣的優勢菌門Chloroflexi和優勢菌屬Defluviicoccus、Candidatus_Competibacter豐度最高，其合成大量有機物，存在CH4排放的潛勢；而Proteobacteria、Bacteroidetes等菌門因微生物蛋白質活性受溫度影響，微生物組豐度降低.

d) 在堿性環境中，微生物胞外聚合物中酸性基團發生了裂解，只有Proteobacteria、Chloroflexi等桿狀菌豐度較高，沒有過量的絲狀菌，且可能因累積的大量有機酸，從而產生了大量類色氨酸. 而pH為中性的環境中，Bacteroidetes、Firmicutes等菌門豐度更高.

e) SO42-濃度對底泥微生物影響較小，但較高SO42-濃度提高了上覆水中Methylocystis、Zavarzinia等微生物豐度，抑制了Methylocystis等厭氧微生物的生長，有利于抑制COD的降解，但可能會造成H2S濃度的提高，這個問題還需進一步研究.