半胱氨酸對模擬體系中丙烯酰胺的抑制作用研究

劉浩東，梁文娟，周艷玲，高晴，和勁松

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

丙烯酰胺是一種小分子水溶性物質(zhì)，1994年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將丙烯酰胺列為2A類致癌物，即“人類可能致癌物”，丙烯酰胺在動物和人體中均可轉(zhuǎn)化為致癌活性產(chǎn)物——環(huán)氧丙酰胺[1]。此外，在細(xì)胞和動物試驗中，丙烯酰胺顯示出神經(jīng)毒性[2]和生殖發(fā)育毒性[3]。2002年，STADLER等[4]首次在油炸或焙烤的馬鈴薯和谷物類食品中發(fā)現(xiàn)了丙烯酰胺，這一發(fā)現(xiàn)使丙烯酰胺成為食品安全領(lǐng)域的研究熱點。食品中丙烯酰胺的產(chǎn)生源自于美拉德反應(yīng)[5]，是由氨基酸和葡萄糖在高溫下所發(fā)生的一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，有研究通過同位素（15N）示蹤證明了丙烯酰胺分子中所有碳原子均來源于天冬酰胺[6]，此為目前比較公認(rèn)的丙烯酰胺形成途徑。

目前，國內(nèi)外對如何抑制食品中丙烯酰胺的生成做了大量研究，主要集中在3個方面：食品原料的選擇[7-8]、添加抑制劑[9-11]以及優(yōu)化加工工藝[12-13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，將生馬鈴薯片進(jìn)行半胱氨酸（L-cysteine，Cys）和熱燙預(yù)處理，油炸后，二者對馬鈴薯片中丙烯酰胺的形成存在協(xié)同阻斷效應(yīng)，協(xié)同作用下的抑制率與兩者單獨作用相比顯著增加，但目前Cys對丙烯酰胺的抑制機(jī)理尚未完全清晰[14]。食品體系中組分復(fù)雜，在進(jìn)行食品中丙烯酰胺的抑制機(jī)理研究時，會受到干擾，因此建立有代表性的葡萄糖/天冬酰胺模擬體系對研究Cys抑制丙烯酰胺的作用機(jī)制和作用位點等具有現(xiàn)實的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純）：德國Merck KGaA公司；丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；Cys（分析純）：德國Sigma-Aldrich有限公司；尼龍注射器過濾器（0.22 μm）、水系濾膜、有機(jī)系濾膜（0.45 μm）：天津津滕實驗設(shè)備有限公司；3，5-二硝基水楊酸（分析純）：上海博研生物科技股份公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（UltiMate 3000）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；超純水系統(tǒng)（Milli-Q）：美國密理博公司；超聲波清洗器（KQ3200E）：昆山市超聲儀器有限公司；恒溫油浴鍋（DF-101）：上海秋佐科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（GZX-GF101-3-BS-Ⅱ）：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；HLB SPE柱（200 mg/6 mL）：江蘇杰島高新材料科技有限公司；水熱合成反應(yīng)釜（YZHR-25）：上海巖征實驗儀器有限公司；真空離心濃縮儀（miVac Quattro）：英國GeneVac公司；電子天平（AR224CN）：奧豪斯儀器（常州）有限公司；可見分光光度計（V-5600）：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖/天冬酰胺模擬體系的建立

配制0.2 mol/L天冬酰胺、0.5 mol/L葡萄糖溶液。提前將水熱合成反應(yīng)釜置于烘箱中預(yù)熱10 min，分別吸取上述天冬酰胺溶液7.0 mL（1.4 mmol）和葡萄糖溶液2.8 mL（1.4 mmol）于預(yù)熱好的水熱合成反應(yīng)釜中，置于2 L油浴鍋中以160、180、200、220℃分別加熱0、5、10、15、20、25、30、35、40 min，反應(yīng)結(jié)束后，冰水浴冷卻至室溫（18℃～25℃）備用。

1.3.2 模擬體系褐變度的測定

采用消光值法[15]測定。將反應(yīng)后的產(chǎn)物用超純水按體積比1∶25稀釋，以超純水為空白對照，于420 nm處測定吸光度A，10為常數(shù)，計算褐變度。

褐變度=10×A

1.3.3 葡萄糖含量的測定

1.3.3.1 3，5-二硝基水楊酸溶液配制

稱取 6.3 g 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶于2.0 mol/L的262 mL的氫氧化鈉溶液中。稱取182.0 g酒石酸鉀鈉于500 mL超純水中，然后將上述兩溶液混合，再加入5.0 g苯酚和5.0 g亞硫酸鈉，45℃水浴，攪拌溶解后定容至1 000 mL，充分混勻，存于棕色瓶中備用。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取經(jīng)105℃干燥2 h的葡萄糖0.10 g，溶解定容至100 mL，配制成1.00 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。分別移取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mL 于試管中，用蒸餾水補(bǔ)至3.50 mL，分別加入2.50 mL DNS試劑，沸水浴加熱8 min，取出后流水冷卻，加入19.00 mL超純水，搖勻、靜置20 min，以相同條件下的空白溶液為參比溶液，在540nm波長下測定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.3 模擬體系中葡萄糖含量的測定

取0.05 mL模擬體系反應(yīng)液于試管中，用超純水補(bǔ)至3.50 mL，加入2.50 mL DNS試劑，沸水浴中加熱8 min，取出后用流水冷卻，加入超純水19.00 mL，搖勻、靜置20 min，以相同條件下的空白溶液為參比溶液，在540 nm波長下測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算模擬體系樣品的葡萄糖含量[16]。

1.3.4 模擬體系中丙烯酰胺含量的測定

1.3.4.1 色譜條件

色譜柱為Syncronis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；流動相為甲醇 ∶水=5 ∶95（體積比）；流速為1 mL/min；柱溫為25℃；檢測波長為210 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

配制0.1 mg/mL的丙烯酰胺儲備液。將儲備液稀釋為 0.4、1.2、2.0、2.8、3.6 μg/mL 5 個低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析；將儲備液稀釋為 4.0、20.0、36.0、52.0、68.0、84.0 μg/mL 5個高濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，以丙烯酰胺濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.3 樣品前處理

準(zhǔn)確吸取樣品2.0 mL，采用等體積的乙酸乙酯液-液萃取3次，將上層液合并至離心管，用真空離心濃縮儀濃縮至干，加入1.5 mL超純水重溶，然后選用HLB SPE柱進(jìn)行純化，用3.0 mL甲醇活化和3.0 mL超純水平衡，吸取上述重溶樣液通過HLB SPE柱，棄去濾液，然后用3.0 mL超純水洗脫并收集該洗脫液，過0.22 μm 濾膜，進(jìn)樣分析[17]。

1.3.5 Cys與丙烯酰胺在不同摩爾比下的反應(yīng)

配制5 mL 0.1 mg/mL（7 nmol）丙烯酰胺溶液加入水熱合成反應(yīng)釜，再分別加入 0、7、42、84、420 nmol Cys，相當(dāng)于丙烯酰胺摩爾質(zhì)量的 0、1、6、12、60 倍，用超純水補(bǔ)足體積至10 mL，分別將水熱合成反應(yīng)釜在180℃下加熱25 min，測定丙烯酰胺含量。

1.3.6 丙烯酰胺抑制率計算

丙烯酰胺抑制率按如下公式計算。

式中：C0為對照組丙烯酰胺含量，μg；Ct為Cys試驗組丙烯酰胺含量，μg。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Origin 2018軟件繪圖，應(yīng)用SPSS Ver.18.0進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。每個樣品3個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱時間和溫度對模擬體系的影響

2.1.1 褐變度的變化

試驗比較了不同加熱溫度和不同加熱時間下模擬體系褐變度的變化，結(jié)果見圖1。

圖1 不同溫度和加熱時間模擬體系褐變度的變化Fig.1 The change of browning degree of the model system at different temperature and heating time

由圖1可知，在160℃下，模擬體系的褐變度在40 min內(nèi)隨加熱時間的延長而升高，未觀察到峰值出現(xiàn)，可能需要更長的加熱時間才能達(dá)到峰值；在180、200、220℃下，體系的褐變度總體上呈現(xiàn)出一個先升高后下降的趨勢，峰值出現(xiàn)時間分別為35、20、15 min。說明起始溫度越高，模擬體系越易于發(fā)生褐變。

美拉德反應(yīng)從感官上分析首先是一個褐變的過程，引起褐變的主要原因是類黑精的生成，類黑精是美拉德反應(yīng)后期由二羰基化合物、還原酮類和裂解的醛等物質(zhì)，經(jīng)過進(jìn)一步縮合形成的復(fù)雜高分子，雖然其具體結(jié)構(gòu)還不清楚，但有大量的文獻(xiàn)表明類黑精是美拉德反應(yīng)的主要產(chǎn)物，也是主要的呈色產(chǎn)物，其含量可以反映出最終反應(yīng)程度[18]。本研究對不同溫度設(shè)定下模擬體系發(fā)生褐變反應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，起始溫度較高的條件下更易于在短時間內(nèi)出現(xiàn)褐變并達(dá)到峰值。

2.1.2 丙烯酰胺含量的變化

不同濃度范圍的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

由圖2a可知，高濃度范圍丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 Y=0.9119X+0.5663，R2=0.9996，適用于計算 4μg/mL～84 μg/mL的丙烯酰胺溶液。由圖2b可知，低濃度范圍丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.966 3X+0.013 7，R2=0.995 2，適用于計算 0.4 μg/mL～3.6 μg/mL 的丙烯酰胺溶液。

圖2 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for acrylamide

不同加熱時間及不同加熱溫度對模擬體系丙烯酰胺含量影響見圖3。

圖3 不同溫度和加熱時間模擬體系丙烯酰胺含量的變化Fig.3 The change of acrylamide content in the model system at different temperature and heating time

由圖3可知，加熱溫度越高，體系產(chǎn)生丙烯酰胺越早，除160℃，丙烯酰胺含量隨加熱時間延長均呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢。在160℃下，丙烯酰胺含量隨時間延長而升高，40 min時仍有上升趨勢；在220℃下，10 min以內(nèi)開始生成丙烯酰胺，15 min時達(dá)到最大值（720.6±24.1）μg，然后開始下降；在 200℃下，15 min以內(nèi)生成丙烯酰胺，20 min時達(dá)到最大值（675.4±9.7）μg，然后開始下降；在180℃下，15 min以內(nèi)生成丙烯酰胺，30 min 時達(dá)到最大值（711.6±19.5）μg，然后開始下降。溫度大于或等于180℃時丙烯酰胺含量隨時間延長先升高后下降，這主要是因為溫度高于170℃時丙烯酰胺會發(fā)生降解[19]。

2.2 Cys對模擬體系的影響

2.2.1 Cys添加量對模擬體系中丙烯酰胺含量的影響

不同Cys添加量對模擬體系中丙烯酰胺含量的影響見圖4。

圖4 不同Cys添加量對模擬體系中丙烯酰胺含量的影響Fig.4 Effect of different Cys supplemental amount on the content of acrylamide in model system

由圖4可知，Cys添加量越高，丙烯酰胺抑制率越高，添加量為5.0 mg時效果開始顯著（P<0.05），丙烯酰胺抑制率為（19.9±3.9）%，添加量為50.0 mg時，丙烯酰胺抑制率為（72.2±5.3）%。當(dāng)Cys添加量為100.0 mg時，丙烯酰胺抑制率達(dá)到（93.8±0.2）%。本研究的模擬體系中，Cys添加量越高，對模擬體系的丙烯酰胺抑制效果越好，當(dāng)添加量達(dá)100.0 mg時抑制率在90%以上，Cys的分子結(jié)構(gòu)中含有活潑的巰基，容易與丙烯酰胺中的雙鍵發(fā)生加成反應(yīng)，從而降低丙烯酰胺的含量[20]。

2.2.2 Cys與丙烯酰胺不同摩爾比下對丙烯酰胺抑制率的影響

不同摩爾比下Cys對丙烯酰胺抑制率的影響見圖5。

由圖5可知，未添加Cys的情況下丙烯酰胺含量降低，這可能是因為高溫下丙烯酰胺發(fā)生消解，當(dāng)Cys添加量為42 nmol時，丙烯酰胺抑制率為（89.4±4.4）%；當(dāng)Cys添加量為84 nmol時，丙烯酰胺抑制率為（92.3±4.3）%；當(dāng)Cys添加量為420 nmol時，丙烯酰胺抑制率為（99.2±0.5）%。與圖4的結(jié)果相比，圖5中Cys對丙烯酰胺的抑制率升高，這可能是由于在葡萄糖/天冬酰胺模擬體系中，Cys的分子結(jié)構(gòu)中含有活潑的巰基，會與除丙烯酰胺以外的一些美拉德中間產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，比如和Amadori中間產(chǎn)物反應(yīng)[21]，和醛類等發(fā)生反應(yīng)[22]，導(dǎo)致Cys對丙烯酰胺的抑制率降低。

圖5 不同摩爾比下Cys對丙烯酰胺的抑制率Fig.5 Inhibition rate of Cys to acrylamide under different molar ratios

2.2.3 Cys對模擬體系加熱過程葡萄糖含量變化的影響

圖6為葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=0.535 2X-0.010 0，R2=0.996 0），適用于計算含有0.25 mg～1.75 mg葡萄糖的模擬體系樣品。

圖6 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of glucose

有文獻(xiàn)報道，在高溫下Cys和葡萄糖會發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生吡咯噻唑鹽等物質(zhì)[23]，為探究在加熱過程中，Cys對模擬體系中葡萄糖含量變化的影響，設(shè)立添加50.0 mg Cys組和空白對照組，在180℃下加熱0～40 min，測定葡萄糖含量，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，在加熱初期葡萄糖含量下降緩慢，到15 min時葡萄糖含量開始快速下降。試驗組和空白對照組相比，葡萄糖含量下降趨勢一致，差異不大，推測在模擬體系中，Cys對葡萄糖含量沒有影響。

圖7 Cys對模擬體系中葡萄糖含量的影響Fig.7 Effect of Cys on glucose content in model system

2.2.4 Cys對模擬體系加熱過程褐變度變化的影響

為探究在加熱過程中，Cys對模擬體系褐變度變化的影響，設(shè)立添加Cys（50.0 mg）的試驗組和空白對照組，在180℃下加熱0～40 min，測定褐變度，結(jié)果見圖8。

圖8 Cys對模擬體系褐變度的影響Fig.8 Effect of Cys on browning degree of model system

由圖8可知，對照組的褐變度從10 min開始迅速升高，35 min達(dá)到峰值后下降，試驗組隨著時間延長褐變度升高緩慢，在35 min達(dá)到峰值，加入50.0 mg Cys后褐變度在峰值處降低了（62.0±1.7）%。說明Cys對模擬體系的褐變度具有顯著抑制效果（P<0.05），在反應(yīng)過程中抑制了類黑素的形成，美拉德反應(yīng)被一定程度抑制。

2.2.5 Cys對模擬體系加熱過程丙烯酰胺含量變化的影響

為探究在加熱過程中，Cys對模擬體系丙烯酰胺含量變化的影響，設(shè)立添加Cys（50.0 mg）的試驗組和空白對照組，在180℃下加熱0～40 min，測定丙烯酰胺含量，結(jié)果如圖9所示。

圖9 Cys對模擬體系丙烯酰胺含量的影響Fig.9 Effect of Cys on the content of acrylamide in model system

由圖9可知，空白對照組丙烯酰胺含量上升趨勢明顯，從10 min開始迅速上升，到30 min時達(dá)到峰值（711.6±19.5）μg，然后迅速下降；試驗組丙烯酰胺含量上升趨勢平緩，從15 min開始產(chǎn)生丙烯酰胺，30 min時達(dá)到峰值（150.6±4.0）μg，明顯小于空白對照組的峰值。Cys在整個反應(yīng)過程顯著降低了丙烯酰胺含量（P<0.05），說明在反應(yīng)體系中添加Cys，使抑制丙烯酰胺的生成具有可能性。

3 結(jié)論

本試驗通過建立葡萄糖/天冬酰胺模擬體系，發(fā)現(xiàn)加熱溫度和加熱時間對模擬體系的褐變度及丙烯酰胺含量具有重要影響。溫度達(dá)180℃及以上時，反應(yīng)在40 min內(nèi)模擬體系的褐變度和丙烯酰胺含量均能達(dá)到峰值，隨后降低；反應(yīng)溫度在160℃時，在40 min內(nèi)模擬體系的褐變度和丙烯酰胺含量隨時間延長而升高，推測達(dá)到峰值需要更長時間。添加Cys后，Cys含量對模擬體系中丙烯酰胺的形成具有影響，結(jié)果顯示Cys添加量越高，對丙烯酰胺的抑制效果越強(qiáng)，當(dāng)Cys添加量為100.0 mg時，丙烯酰胺的抑制率達(dá)到（93.8±0.2）%，且Cys對單一丙烯酰胺的抑制效果強(qiáng)于Cys對模擬體系中丙烯酰胺的抑制效果，可能是因為模擬體系中的中間產(chǎn)物影響了Cys的抑制作用，具體原因有待進(jìn)一步研究。在180℃模擬體系中Cys添加量達(dá)50.0 mg時褐變度及丙烯酰胺含量升高趨勢與對照組相比較緩慢，且峰值顯著降低（P<0.05），對葡萄糖含量的變化趨勢無明顯影響，推測Cys能在不影響葡萄糖含量的前提下，顯著降低反應(yīng)體系中丙烯酰胺含量及褐變度。本研究可以為后續(xù)探究Cys對熱加工食品中丙烯酰胺的抑制機(jī)理及作用位點提供一定的數(shù)據(jù)支撐。