燕窩飲料及游離唾液酸對(duì)小鼠免疫功能調(diào)節(jié)作用研究

陳斯瑋，劉明華，鄒順梅，楊小會(huì)，張丹

（西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000）

燕窩又名燕根、燕菜、燕蔬菜，為雨燕科（Apodidae）金絲燕屬（Collocalia）的幾種鳥類動(dòng)物及多種同屬燕類用唾液與絨羽等混合凝結(jié)所筑成的巢窩[1-2]。燕窩主產(chǎn)于東南亞，最早由鄭和下西洋時(shí)帶回我國(guó)[3]。燕窩按其來源分為屋燕和洞燕，按其質(zhì)地分為白燕、紅燕等，具有豐富的藥用價(jià)值。現(xiàn)代研究表明[4-6]，燕窩可增強(qiáng)免疫功能，有延緩衰老、延年益壽的功效。燕窩酸又名唾液酸，為燕窩主要有效成分，學(xué)名N-乙酰神經(jīng)氨酸，是由燕窩的特征成分唾液酸糖蛋白在一定的酸性條件下水解出的游離唾液酸[7]，具有多種生物調(diào)節(jié)功能，如抗老年癡呆、抗病毒、抗炎癥和抑制白細(xì)胞的黏附等[8]。蔣林等[9]認(rèn)為燕窩具有抗病毒、促細(xì)胞分裂、改善骨骼強(qiáng)度與真皮厚度、免疫促進(jìn)等功效，張玫等[10]發(fā)現(xiàn)燕窩提取液既能提高小鼠的細(xì)胞免疫功能又能提高體液免疫功能。唾液酸是衡量燕窩品質(zhì)高低的重要指標(biāo)，也是燕窩中最主要的生物活性成分，將其添加到食品中具有一定的免疫促進(jìn)功能，但目前尚未見相關(guān)研究。

人體多種細(xì)胞都可通過胞飲、細(xì)胞內(nèi)吞等方式吸收外源性的游離唾液酸，故直接補(bǔ)充游離唾液酸已成為外源性補(bǔ)充唾液酸的主要方法[11]，常見于糖果、嬰幼兒奶粉等。國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)2017年已批準(zhǔn)了N-乙酰神經(jīng)氨酸（唾液酸）作為新食品原料[12]。

為探究食品中游離唾液酸的添加對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用，本研究選用燕窩飲料（含有燕窩及游離唾液酸的風(fēng)味飲品）及游離唾液酸（純度≥98%），通過免疫相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定[脾（胸腺）指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率、吞噬指數(shù)、半數(shù)溶血值HC50、左右耳腫脹度、增殖指數(shù)（proliferation index，PI）][13-15]，觀察其對(duì)免疫低下小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，旨在為燕窩飲料及游離唾液酸在營(yíng)養(yǎng)健康食品領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)的試驗(yàn)依據(jù)及理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與動(dòng)物

燕窩飲料（批號(hào)：20190812，燕窩 10 mg/罐，游離唾液酸11 mg/罐）：廣州華人愛燕窩有限公司；游離唾液酸（純度≥98%）：西安維特生物科技有限公司；昆明種小白鼠[（18 g～22 g，雌雄各半，合格證號(hào)：SCXK（川）2013-017）]：西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 試劑

環(huán)磷酰胺：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；轉(zhuǎn)移因子膠囊（3 mg）：成都利爾藥業(yè)有限公司；雞紅細(xì)胞（chicken red blood cell，CRBC）：碧云天生物有限公司；CA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所；RPMI1640培養(yǎng)基：Gibco公司；胎牛血清：杭州四季青公司；Giemsa染液：上海生工生物工程有限公司；刀豆蛋白（ConA）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美國(guó)Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

BT323S電子天平：德國(guó)Sartoriugo公司；GS-15R高速冷凍離心機(jī)、MSD97K49微量離心機(jī)：美國(guó)Beckman公司；SPECTRA MAX190酶標(biāo)儀：美國(guó)MD公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒醫(yī)療器械有限公司；37XFPC光學(xué)顯微鏡：上海光學(xué)儀器六廠；WB100-4F恒溫水浴箱：江蘇奈樂儀器設(shè)備制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫低下小鼠臟器指數(shù)測(cè)定

將84只小鼠隨機(jī)分為7組，每組12只，分別為陰性對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照及燕窩飲料A劑量組、燕窩飲料B劑量組、游離唾液酸C劑量組、游離唾液酸D劑量組。除陰性對(duì)照組外其余6組分別于給藥前3 d腹腔注射75 mg/kg新配制的環(huán)磷酰胺，連續(xù)3 d，制備免疫功能低下小鼠模型[16-17]。然后每天灌胃給藥2次，陰性對(duì)照組和模型對(duì)照組用等體積的0.9%生理鹽水，陽性對(duì)照組灌胃給予轉(zhuǎn)移因子，以多肽計(jì)為3.00 mg/（kg·d），燕窩飲料A劑量組、燕窩飲料B劑量組給予燕窩飲料，游離唾液酸C劑量組、游離唾液酸D劑量組給予游離唾液酸，每天灌胃2次，每次0.2 mL/10 g bw，連續(xù)28 d[18-20]。其中，飲料組和游離唾液酸組用量如下。

1）燕窩飲料A劑量組：1.83 mg/（kg·d），相當(dāng)于成人1罐/d的飲用量；2）燕窩飲料B劑量組：3.67 mg/（kg·d），相當(dāng)于成人2罐/d的飲用量；3）游離唾液酸C劑量組：12.50 mg/（kg·d），相當(dāng)于成人75 mg/d的唾液酸；4）游離唾液酸D劑量組：25.00 mg/（kg·d），相當(dāng)于成人150 mg/d的唾液酸。

末次灌胃后1 h，處死小鼠，剖取脾臟和胸腺，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，按下列公式計(jì)算脾（胸腺）指數(shù)。

1.3.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

小鼠分組和給藥同1.3.1，于末次給藥當(dāng)日每只小鼠腹腔注射2%淀粉1 mL，24 h后每只小鼠腹腔注射0.5 mL新鮮配制的5%雞紅細(xì)胞。處死小鼠，剪開腹部，經(jīng)腹膜注射生理鹽水（normal saline，NS）2 mL，輕揉腹部1 min后，吸出腹腔洗液涂片于載玻片上。將玻片置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱溫育30 min，用NS漂洗、晾干，用體積比1∶1的丙酮-甲醇溶液固定2 min。晾干后，涂片Giemsa染色30 min，蒸餾水漂洗，磷酸鹽緩沖液分色，晾干。油鏡下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞（macrophages，M?），每片200個(gè)按下式計(jì)算巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

1.3.3 三硝基氯苯（picryl chloride，PC）誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)

小鼠分組給藥同1.3.1，連續(xù)灌胃28 d。第22天用刀片給小鼠腹部去毛，范圍約9 cm2。用微量進(jìn)樣器取1%PC無水乙醇溶液100 μL，均勻涂抹在剃毛區(qū)致敏，并用吹風(fēng)機(jī)吹干。致敏第7天，將1%PC橄欖油溶液30 μL均勻涂抹于每鼠右耳（兩面）進(jìn)行攻擊。抗原攻擊24 h后，將小鼠脫臼處死，沿耳廓基線剪下左右耳殼，用打孔器于同一部位分別取下直徑8 mm的耳片，并稱重，按下式計(jì)算腫脹度。

1.3.4 血清溶血素形成實(shí)驗(yàn)

小鼠分組給藥同1.3.1，灌胃28 d后，每只小鼠腹腔注射0.5 mL 5%雞紅細(xì)胞致敏。免疫7 d，摘眼球取血并分離血清。取稀釋100倍血清1mL加5%雞紅細(xì)胞、0.5 mL 10%補(bǔ)體混勻，置37℃恒溫水浴箱溫浴30 min，取出放在冰水冷卻，離心，取上清液，測(cè)其吸光度A540，以半數(shù)溶血值HC50表示溶血素水平。

HC50=樣品A540/半數(shù)溶血A540×樣品稀釋倍數(shù)

1.3.5 ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)

84只小鼠，分組給藥同1.3.1，灌胃28 d，于末次給藥24 h后頸椎脫臼處死小鼠，泡入70%酒精，5 min，無菌取脾，放入含抗生素生理鹽水的培養(yǎng)皿內(nèi)。浸泡20 min后將脾臟剪切成2 mm2～3 mm2的小塊，用毛玻片研磨碎，然后用200目不銹鋼細(xì)胞篩過濾，離心后用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)成濃度為3×106mg/mL的細(xì)胞懸液。分兩孔加入96孔培養(yǎng)板，每孔 90 μL，一孔加入 10 μL 0.1 mg/mL ConA（終濃度為 10 μg/mL）作為實(shí)驗(yàn)組，另一孔加入 10 μL培養(yǎng)液作為對(duì)照組。培養(yǎng)48 h后每孔加入CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度A450值，按下列公式計(jì)算增殖指數(shù)（PI）。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕窩飲料及游離唾液酸對(duì)免疫器官質(zhì)量的影響

燕窩飲料及游離唾液酸對(duì)免疫低下小鼠免疫器官質(zhì)量的影響見表1。

表1 燕窩飲料及游離唾液酸對(duì)免疫低下小鼠免疫器官質(zhì)量的影響Table 1 Effect of bird's nest beverage and free sialic acid on the weight of immune organs in immunocompromised mice

由表1可知，與陰性對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)極顯著下降（P<0.01），說明免疫功能低下小鼠模型建立成功。與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照及燕窩飲料B劑量組、游離唾液酸C劑量組、游離唾液酸D劑量組能顯著提高免疫低下小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)（P<0.05，P<0.01）。

2.2 燕窩飲料及游離唾液酸對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的情況見圖1，燕窩飲料及游離唾液酸對(duì)免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響見表2。

圖1 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的情況Fig.1 Intraperitoneal macrophages phagocytosis of chicken erythrocytes

由圖1及表2可知，與陰性對(duì)照組比較，模型對(duì)照小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)及吞噬百分率明顯降低（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照及燕窩飲料B劑量組、游離唾液酸C劑量組、游離唾液酸D劑量組均能升高免疫低下小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)及吞噬百分率，有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 燕窩飲料及游離唾液酸對(duì)免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響Table 2 Effect of bird's nest beverage and free sialic acid on phagocytic function of peritoneal macrophages in immunocompromised mice

2.3 燕窩飲料及游離唾液酸對(duì)小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響

燕窩飲料及游離唾液酸對(duì)免疫低下小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響見表3。

表3 燕窩飲料及游離唾液酸對(duì)免疫低下小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響Table 3 Effect of bird's nest beverage and free sialic acid on delayed allergic reaction in immunocompromised mice

由表3可知，與陰性對(duì)照組比較，模型對(duì)照小鼠耳廓腫脹度極顯著降低（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，各劑量組免疫低下小鼠的耳廓腫脹度無明顯改變，差異無顯著性（P＞0.05）。

2.4 燕窩飲料及游離唾液酸對(duì)小鼠血清溶血素形成的影響

燕窩飲料及游離唾液酸對(duì)免疫低下小鼠血清溶血素形成的影響見表4。

表4 燕窩飲料及游離唾液酸對(duì)免疫低下小鼠血清溶血素形成的影響Table 4 Effect of bird's nest beverage and free sialic acid on serum hemolysin formation in immunocompromised mice

由表4可知，與陰性對(duì)照組比較，模型對(duì)照小鼠血清溶血素值下降極顯著（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照及燕窩飲料B劑量組、游離唾液酸C劑量組、游離唾液酸D劑量組免疫低下小鼠的小鼠血清溶血素值升高，差異有顯著性（P＜0.05，P＜0.01），且劑量越大，血清溶血素值越高。

2.5 燕窩飲料及游離唾液酸對(duì)ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

燕窩飲料及游離唾液酸對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響見圖2。

圖2 燕窩飲料及游離唾液酸對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響Fig.2 Effect of bird's nest beverage and free sialic acid on ConA induced lymphocyte transformation in mice

由圖2可知，與陰性對(duì)照組比較，模型對(duì)照小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)明顯下降，差異有極顯著性（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組與游離唾液酸D劑量組可促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，差異有顯著性（P＜0.05或 P＜0.01）。

3 討論與結(jié)論

環(huán)磷酰胺常被國(guó)內(nèi)外研究者用于建立小鼠免疫抑制模型，以觀察免疫促進(jìn)藥物對(duì)免疫功能的影響。免疫器官的臟器系數(shù)和單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)，巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)的大小可以反映內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)吞噬功能的強(qiáng)弱，當(dāng)細(xì)菌、異物等抗原性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后，可迅速被單核巨噬系統(tǒng)吞噬和清除。血清溶血素水平可以反應(yīng)機(jī)體內(nèi)抗體量，反映B淋巴細(xì)胞體液免疫功能，在試驗(yàn)中SRBC致敏的動(dòng)物血清中存在循環(huán)抗體lgM和lgG，抗體與SRBC，在體外補(bǔ)體的參與下產(chǎn)生溶血反應(yīng)，用分光光度計(jì)測(cè)定溶血程度來反應(yīng)抗體水平。在免疫系統(tǒng)中，T淋巴細(xì)胞經(jīng)ConA等激活后，轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，可介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，并輔助機(jī)體針對(duì)T細(xì)胞依賴性抗原產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，因此，脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)可以作為機(jī)體細(xì)胞免疫功能的指標(biāo)之一。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，燕窩飲料及游離唾液酸均可提高巨噬細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)，可促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)劑量關(guān)系。燕窩飲料A劑量組對(duì)各項(xiàng)免疫指標(biāo)均無明顯影響；燕窩飲料B劑量組能提高小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)（P＜0.05），提高小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)及吞噬百分率（P＜0.05），升高小鼠血清溶血素含量（P＜0.05），對(duì)促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及對(duì)小鼠耳廓腫脹度均無影響，具有一定的增強(qiáng)小鼠免疫功能作用；游離唾液酸C劑量組能提高小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)（P＜0.01），提高小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)及吞噬百分率（P＜0.05），升高小鼠血清溶血素含量（P＜0.01），對(duì)促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及對(duì)小鼠耳廓腫脹度均無影響，具有較明顯的增強(qiáng)小鼠免疫功能作用；游離唾液酸D劑量組除能提高小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)（P＜0.01），提高小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)及吞噬百分率（P＜0.05），升高小鼠血清溶血素含量（P＜0.01）外，還能促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)（P＜0.05），仍對(duì)小鼠的耳廓腫脹度無影響，具有更明顯的增強(qiáng)小鼠免疫功能作用。

綜上所述，在食品或飲料中添加游離唾液酸對(duì)小鼠的免疫功能有顯著調(diào)節(jié)作用，且隨著劑量的增加，作用越明顯。