玫瑰茄花色苷純化過程中有機(jī)酸的回收及其性質(zhì)研究

趙彥巧，李彬，郭美辰，王炳君，呂金烏，劉趙豐，劉瑩，韋元桃

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa），又稱為洛神花[1]。玫瑰茄花萼中有機(jī)酸含量高達(dá)16.67%～33.33%，其中草酸和琥珀酸含量最高[2]。已有文獻(xiàn)表明，玫瑰茄有機(jī)酸具有抗癌[3]、抗氧化[4]、抗炎癥[5]以及抑制 α-淀粉酶活性[6]等作用，因此玫瑰茄有機(jī)酸的應(yīng)用前景十分寬闊。

玫瑰茄曬干后可制作為花茶產(chǎn)品[7]。近年來，國內(nèi)研究主要集中在玫瑰茄花萼的成分分析及產(chǎn)品初加工方面[8-9]，但對于有機(jī)酸及其他活性物質(zhì)等成分的重點(diǎn)研究較少。目前，玫瑰茄花色苷的提取、純化技術(shù)已經(jīng)成熟，樹脂吸附法因具有污染少、提取效率高、可以反復(fù)利用以及生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)[10]，常被廣泛應(yīng)用于有機(jī)酸提取和制備工藝的研究中[11-12]。因此本研究采用陰離子-陽離子交換柱聯(lián)合法回收有機(jī)酸流出液，測定樹脂吸附效能，并通過研究有機(jī)酸的性質(zhì)，為玫瑰茄有機(jī)酸的研究及功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰茄：產(chǎn)自云南省武定市；AB-8型大孔樹脂：安徽省三星樹脂有限公司；D301弱堿性陰離子交換樹脂：天津市津達(dá)正通環(huán)保科技有限公司；001×7強(qiáng)酸性氫型陽離子交換樹脂：河北省斯福萊德水處理公司；DPPH（分析純）：東京化成工業(yè)株式會社；水溶性維生素E（Trolox，分析純）：北京源葉生物科技有限公司；ABTS（分析純）：上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)（ST3100）：奧豪斯儀器有限公司；數(shù)顯型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV10）：德國IKA公司；實(shí)驗(yàn)型噴霧干燥機(jī)（YC-015）：上海雅程儀器設(shè)備有限公司；掃描電鏡（S-4800）：日本 Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰茄花萼前處理

玫瑰茄低溫烘干并粉碎，篩選出尺寸為250 μm～425 μm的顆粒物，4℃冷藏備用。

1.3.2 樹脂的預(yù)處理及再生

AB-8型大孔樹脂按照郭慶啟等[13]的處理方法進(jìn)行預(yù)處理。

D301弱堿性陰離子交換樹脂[14-15]和001×7強(qiáng)酸性氫型陽離子交換樹脂按照展亞莉等[16]的處理方法進(jìn)行預(yù)處理。

D301弱堿性陰離子交換樹脂再生：取適量使用過的D301樹脂，以4倍體積2 mol/L NaOH溶液浸泡，動態(tài)吸附4 h后，用蒸餾水洗至中性。

001×7強(qiáng)酸性氫型陽離子交換樹脂再生：取適量使用過的001×7樹脂，以4倍體積3%HCl溶液浸泡，動態(tài)吸附4 h后，用蒸餾水洗至中性。

1.3.3 玫瑰茄花色苷提取純化

按照孟翔宇[8]的操作方法得到玫瑰茄花色苷粗提液，5 000 r/min、4℃離心10 min后，取上清液進(jìn)行減壓蒸餾、真空干燥，得到玫瑰茄花色苷粗提粉。以3mg/mL花色苷溶液（pH2.46）為上樣液，按上樣液∶樹脂=25∶1（體積比）上柱，回收流出液，并測其pH值。

稱取20 g預(yù)處理后的D301樹脂裝柱，以AB-8型大孔樹脂純化玫瑰茄花色苷過程中回收的溶液為上樣液，動態(tài)吸附流速2.0 mL/min，測定流出液pH值，直至pH值有明顯下降時停止上柱；蒸餾水洗至流出液呈中性，用0.5 mol/L NaOH溶液上柱洗脫，收集洗脫液。稱取20 g預(yù)處理后的001×7型樹脂，以過D301柱后的洗脫液為上樣液，動態(tài)吸附流速2.0 mL/min，測定樹脂的吸附效能，收集流出液直至流出液pH值≥7，即得到有機(jī)酸溶液。

再生后樹脂的吸附效能測定同上述方法。

1.3.4 回收玫瑰茄有機(jī)酸

玫瑰茄有機(jī)酸溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)真空濃縮后，進(jìn)行噴霧干燥，條件為流速55 mL/h、進(jìn)氣溫度190℃、出氣溫度75℃，即得到玫瑰茄有機(jī)酸粉末狀樣品。

1.3.5 玫瑰茄有機(jī)酸粉末狀樣品的形態(tài)觀察

用掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察玫瑰茄有機(jī)酸粉末狀樣品的表面形態(tài)，掃描電壓為3.0 kV。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的測定

取不同質(zhì)量濃度（0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22、0.24、0.26mg/mL）的有機(jī)酸溶液 0.5mL、1.0mL0.1mmol/L DPPH-乙醇溶液和1.5 mL無水乙醇，避光靜置30 min，在517 nm處測定吸光度，按下式計(jì)算清除率。對照組為Trolox，每份處理做3個平行[17]。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為用等量無水乙醇代替DPPH溶液樣品的吸光度；A0為用等量無水乙醇代替有機(jī)酸溶液樣品的吸光度。

1.3.7 ABTS+自由基清除能力的測定

配制ABTS+母液：將245 μL 100 mmol/L過硫酸鉀溶液置于10 mL容量瓶中，加入9.5 mL 7.0 mmol/L ABTS+溶液，用水補(bǔ)齊至刻度，混合均勻，用錫紙包裹容量瓶避光靜置16 h。向pH7.4的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS） 中滴加 ABTS+母液，測得A(734nm)=0.7±0.02，即得ABTS+工作液。取不同質(zhì)量濃度（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/mL）的有機(jī)酸溶液300 μL加入3.0 mL ABTS+工作液，避光反應(yīng)6 min，于734 nm處測定吸光度，按下式計(jì)算清除率。對照組為Trolox，每份處理做3個平行[18-19]。

ABTS+自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為用等量無水乙醇代替ABTS+溶液樣品的吸光度；A0為用等量無水乙醇代替有機(jī)酸溶液樣品的吸光度。

1.3.8 羥基自由基清除能力的測定

分別配制4.5 mmol/L水楊酸、4.0 mmol/L FeSO4和8.8 mmol/L H2O2，備用。取0.5 mL不同質(zhì)量濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/mL） 玫瑰茄有機(jī)酸溶液與1 mL 4.0 mmol/L FeSO4以及1 mL 4.5 mmol/L水楊酸混合均勻，最后加入1.0 mL H2O2啟動反應(yīng)，避光靜置30 min，于510 nm下測定吸光度，按下式計(jì)算清除率。對照組為Trolox，每份處理做3個平行[20]。

羥基自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A3]×100

式中：A1為0.5 mL樣品+1.0 mL FeSO4+1.0 mL水楊酸-乙醇+1.0 mL H2O2在510 nm的吸光度；A2為0.5 mL樣品+1.0 mL FeSO4+1.0 mL水楊酸-乙醇+1.0 mL H2O在510 nm的吸光度；A3為0.5 mL蒸餾水+1.0 mL FeSO4+1.0 mL水楊酸-乙醇+1.0 mL H2O2在510 nm的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)和繪圖使用IBM SPSS Statistics 25和Origin pro8處理。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用單因素檢驗(yàn)和Duncan分析評估每組平均值之間的差異（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 D301弱堿性陰離子交換樹脂吸附效能及再生后的吸附效能

D301樹脂柱流出液pH值隨上樣液體積變化見圖1。

圖1 D301樹脂流出液pH值隨上樣液體積變化Fig.1 The pH of D301 resin effluent varies with the volume of sample solution

由圖1可知，隨著上樣液體積增加，流出液的pH值先在7～8浮動；當(dāng)上樣液體積總和達(dá)到700 mL～800 mL時，流出液pH值開始下降，隨后下降趨勢加快；當(dāng)上樣液體積達(dá)到1 300 mL～1 400 mL時，流出液pH值降至2.3左右。原因是隨著上樣液體積增加，D301樹脂吸附能力逐漸達(dá)到飽和，當(dāng)上樣量超過大孔樹脂與有機(jī)酸分子之間的范德華力時，樹脂床層發(fā)生泄露，流出液pH值下降[21]。因此上樣液體積應(yīng)控制在800 mL以內(nèi)。

再生后的D301樹脂柱流出液pH值隨上樣液體積變化見圖2。

圖2 再生后的D301樹脂流出液pH值隨上樣液體積變化Fig.2 The pH of D301 resin effluent after regeneration varies with the volume of sample solution

由圖2可知，隨著上樣液體積增加，流出液的pH值先在7～8浮動；當(dāng)上樣液體積總和達(dá)到350 mL時，流出液pH值開始下降，隨后下降趨勢明顯，說明已經(jīng)達(dá)到泄露點(diǎn)；當(dāng)上樣液體積達(dá)到600 mL時，流出液pH值降至2.4左右。可以看出再生后的D301樹脂吸附能力僅為初始D301樹脂的50%，再生后的D301樹脂上樣液體積應(yīng)控制在350 mL以內(nèi)。

2.2 001×7強(qiáng)酸性氫型陽離子交換樹脂吸附效能

001×7樹脂柱流出液pH值隨上樣液體積變化見圖3。

圖3 001×7樹脂柱流出液pH值隨上樣液體積變化Fig.3 The pH of 001×7 resin effluent varies with the volume of sample solution

由圖3可知，在0～30 mL范圍內(nèi)，隨著上樣液體積增加，流出液的pH值呈下降趨勢降；當(dāng)上樣液體積總和超過30 mL時，流出液pH值開始上升，且當(dāng)上樣液體積總和達(dá)到55 mL時，流出液pH值升至7.6。這是因?yàn)樯蠘右旱闹饕煞譃橛袡C(jī)酸鈉鹽，用001×7型樹脂去掉鈉離子得到有機(jī)酸[22]，當(dāng)上樣液體積達(dá)到30 mL時，001×7樹脂吸附能力達(dá)到飽和，導(dǎo)致流出液pH值上升。因此上樣液體積應(yīng)控制在30 mL以內(nèi)。

再生后的001×7樹脂柱流出液pH值隨上樣液體積變化見圖4。

圖4 再生后的001×7樹脂柱流出液pH值隨上樣液體積變化Fig.4 The pH of 001×7 resin effluent after regeneration varies with the volume of sample solution

由圖4可知，隨著上樣液體積增加，流出液的pH值呈先下降后上升的趨勢；當(dāng)上樣液體積總和達(dá)到20 mL時，pH值下降至2.5；繼續(xù)增加上樣液體積，流出液pH值開始上升，且當(dāng)上樣液體積總和達(dá)到25 mL時，流出液pH值升至7以上。因此上樣液體積應(yīng)控制在20 mL以內(nèi)，可以看出再生后的001×7樹脂吸附能力與001×7樹脂相差不大，可以回收利用。

2.3 玫瑰茄有機(jī)酸粉末狀樣品的SEM結(jié)果

玫瑰茄有機(jī)酸粉末狀樣品的形態(tài)見圖5。

圖5 玫瑰茄有機(jī)酸粉末狀樣品的SEM圖Fig.5 SEM image of roselle organic acid powder product

由圖5可知，有機(jī)酸粉末大多呈球形，這是由于料液在噴霧干燥的過程中經(jīng)過霧化器時會形成微小液滴，在瞬時高溫的作用下脫水而保留了液滴球形的形狀。有機(jī)酸粉末表面粗糙，有少部分呈不規(guī)則形狀。推測可能是在較高的入口溫度條件下，水分快速蒸發(fā)，有機(jī)酸種類繁多導(dǎo)致形成形狀各異的晶體；也可能是噴霧干燥進(jìn)出口溫度差距太大，導(dǎo)致在粉末形成過程中熱負(fù)荷過高，導(dǎo)致球體破裂[23]。

2.4 玫瑰茄有機(jī)酸對DPPH自由基的清除能力

玫瑰茄有機(jī)酸對DPPH自由基的清除能力見圖6。

圖6 玫瑰茄有機(jī)酸對DPPH自由基的清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging activity of roselle organic acid

由圖6可知，在0.10 mg/mL～0.26 mg/mL范圍內(nèi)，對照組清除率均在95%以上，而玫瑰茄有機(jī)酸在質(zhì)量濃度為0.22 mg/mL時，清除率接近對照組，在0.26 mg/mL時清除率達(dá)到最大（96.24%）。表明玫瑰茄有機(jī)酸中具有能與DPPH自由基所含單電子配對的電子，且有機(jī)酸濃度越高，DPPH自由基清除效果越好。

2.5 玫瑰茄有機(jī)酸對ABTS+自由基的清除能力

ABTS+自由基同樣含有單電子，但不同的有機(jī)酸對單電子的清除效果不同，且這種清除效果與有機(jī)酸濃度有密切的關(guān)系[24]。玫瑰茄有機(jī)酸對ABTS+自由基的清除能力見圖7。

圖7 玫瑰茄有機(jī)酸對ABTS+自由基的清除能力Fig.7 ABTS+radical scavenging activity of roselle organic acid

由圖7可知，隨著有機(jī)酸濃度的增加，玫瑰茄有機(jī)酸對ABTS+自由基的清除率持續(xù)升高，表明玫瑰茄有機(jī)酸中具有與ABTS+自由基配對的電子。在質(zhì)量濃度0.20 mg/mL～1.00 mg/mL范圍內(nèi)，玫瑰茄有機(jī)酸和對照組清除率最高可達(dá)99.23%和98.77%。

2.6 玫瑰茄有機(jī)酸對羥基自由基的清除能力

玫瑰茄有機(jī)酸對羥基自由基的清除能力見圖8。

圖8 玫瑰茄有機(jī)酸對羥基自由基的清除能力Fig.8 Hydroxyl radical scavenging activity of roselle organic acid

由圖8可知，玫瑰茄有機(jī)酸與對照組對羥基自由基的清除率均隨著濃度的增加而增加。且在0.40 mg/mL～0.80 mg/mL內(nèi)，玫瑰茄有機(jī)酸對羥基自由基的清除率比對照組強(qiáng)，表明玫瑰茄有機(jī)酸對羥基自由基有很強(qiáng)的清除能力。此結(jié)果與熱陽古·阿布拉等[25]的研究結(jié)果類似，研究發(fā)現(xiàn)同等濃度下喀什石榴有機(jī)酸對羥基自由基清除能力強(qiáng)于抗壞血酸。玫瑰茄有機(jī)酸和對照組對羥基自由基清除率最高可達(dá)95.77%和92.96%。

3 結(jié)論

本研究采用陰離子-陽離子交換柱聯(lián)合法回收玫瑰茄花色苷純化過程中的有機(jī)酸，測定了樹脂吸附效能，并對玫瑰茄有機(jī)酸的性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，D301弱堿性陰離子交換樹脂將有機(jī)酸交換成為有機(jī)酸鈉鹽的效能較強(qiáng)，001×7強(qiáng)酸性氫型陽離子交換樹脂將有機(jī)酸鈉鹽交換成有機(jī)酸的效能較低，需進(jìn)一步試驗(yàn)選取效能更高的樹脂將其替換。經(jīng)掃描電鏡觀察有機(jī)酸粉末發(fā)現(xiàn)，樣品大多數(shù)呈球形，但仍有少部分呈不規(guī)則形狀。通過玫瑰茄有機(jī)酸的體外抗氧化活性試驗(yàn)可知，玫瑰茄有機(jī)酸對ABTS+自由基、DPPH自由基、羥基自由基3種自由基都具有良好的清除能力，其抗氧化能力與有機(jī)酸濃度呈正相關(guān)，最高清除率分別達(dá)到99.23%、96.24%、95.77%。

綜上所述，可利用陰離子-陽離子交換柱聯(lián)合法回收玫瑰茄花色苷純化過程中的有機(jī)酸，且回收的有機(jī)酸具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力，可以為玫瑰茄有機(jī)酸功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)，促進(jìn)玫瑰茄有機(jī)酸在食品與藥品行業(yè)的開發(fā)與利用。