芝麻多肽螯合鈣的制備及其補鈣效果研究

許家寶，賈曉彤，陸世海，崔靖康，焦曉波，王梓源，崔建東*

（1.天津科技大學省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.山東大樹達孚特膳食品有限公司，山東 菏澤 274511）

芝麻渣是芝麻籽榨油后的副產品。通常，每加工1 t芝麻即可獲得1 t左右的濕芝麻渣，由于芝麻渣水分含量高（64%），營養成分豐富，因此特別適合微生物的生長，在氣溫較高的季節，如果不及時進行清理，就會霉變發臭，污染環境。但是當前芝麻渣主要被加工用作飼料或肥料，沒有實現高值化利用。研究表明，芝麻渣中的蛋白質含量高達40%～46%，是一種營養豐富的植物蛋白[1]，由于缺乏芝麻蛋白深加工產品的跟進和研發，導致芝麻蛋白的利用率極低。通過研究表明，蛋白質經過蛋白酶水解后得到的多肽比原蛋白質具有更好的營養特性，而且蛋白多肽能夠以更快的速度通過小腸黏膜，更易被人體吸收[2-3]。酶解產生的蛋白多肽具有多種生理活性功能，如降血脂、抗氧化、抗菌和提高免疫力等作用[4-5]。因此，將芝麻渣中的蛋白質提取出來，通過蛋白酶水解制備成蛋白活性多肽，對于提高芝麻渣高值化利用具有重要意義。

此外，近期的研究證實天然蛋白質經酶解后生成的多肽與金屬元素螯合形成的多肽金屬螯合物可通過小腸直接被人體吸收[6-7]，該螯合物在細胞液作用下螯合鍵斷開，分解為小肽或氨基酸以及金屬離子進入血液，不僅能起到補充礦物質元素的作用，而且還能發揮多肽的生理活性功能。例如，Guo等[8]在小鼠飼料中添加膠原肽-鈣螯合物，喂食4周后，測定各項指標，結果表明膠原肽-鈣螯合物提高了小鼠股骨密度、骨鈣的含量，效果均顯著優于碳酸鈣。Chen等[9]研究在缺鈣小鼠飼料中添加羅非魚魚鱗蛋白多肽-鈣螯合物，結果表明其與酪蛋白磷酸肽具有類似的生理活性。Bi等[10]制備了鹿骨肽-鈣螯合物，發現其在回腸里（pH 7.0，37℃）是穩定的。以上結果表明，蛋白多肽-鈣螯合物不僅有利于鈣在體內的吸收，而且在補鈣的同時還能發揮活性多肽的生理功能，是一種極具開發前景的補鈣營養強化劑。基于此，本研究以芝麻蛋白為原料，采用木瓜蛋白酶與風味蛋白酶復合水解芝麻蛋白，得到芝麻蛋白多肽，并將其螯合制備成芝麻蛋白多肽螯合鈣，考察其對小鼠的補鈣效果及其活性功能，本研究為芝麻渣的高值化利用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芝麻渣（干基蛋白含量40%）：河北多祥益植物油有限責任公司；堿性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（50 U/mg）、水合茚三酮、葡萄糖酸鈣、甘氨酸、乙二胺四乙酸二鈉、丙酮（以上均為分析純）、血鈣檢測濃度試劑盒、組織及血液堿性磷酸酶活性檢測試劑盒：索萊寶生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（2 000 U/mg）、氫氧化鈉、鉻藍黑R指示劑、抗壞血酸（以上均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；風味蛋白酶（30 U/mg）（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；無水氯化鈣（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸（分析純）：天津市化學試劑三廠；昆明小鼠：天津杰柯遜生物技術開發有限公司。

1.2 主要儀器設備

DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器：江蘇金怡儀器科技有限公司；FE20K實驗室pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；Vortex-Genie2旋渦混合器：美國SI公司；H1650臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；UV-5100紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；KQ500E超聲波分散儀：昆山舒美超聲儀器有限公司；LGJ-60A真空冷凍干燥機；上海豫明儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 芝麻蛋白多肽的制備

1.3.1.1 芝麻蛋白的提取及預處理

參考文獻[11]的方法，使用低共熔溶劑（deep eutectic solvent，DES）法提取芝麻渣中蛋白。稱取5 g芝麻蛋白于錐形瓶中，然后加入10 mL蒸餾水勻漿，使用超聲波分散儀在超聲功率400 W下超聲處理30 min后，將蛋白分散于水中，在25℃下攪拌8 h～12 h，使其充分擴散形成蛋白懸濁液。

1.3.1.2 單一蛋白酶水解芝麻蛋白

將預處理后的芝麻蛋白懸濁液分別調至堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶的最適溫度和pH值，再分別加入上述蛋白酶，控制加酶量為底物質量的4%，25℃水浴酶解3 h。沸水浴10 min終止反應，冷卻至25℃，用1mol/L HCl調節pH值至7.0，8 000 r/min離心10 min，取上清液，用蒸餾水稀釋后采用茚三酮比色法測定水解度[12]。

1.3.1.3 雙酶復合水解芝麻蛋白

將預處理后的芝麻蛋白水溶液按照表1的順序酶解，在相應溫度和pH值下進行第一階段水解3 h后，調整溫度和pH值，進行第二階段水解，3 h后，沸水浴10 min終止反應，冷卻至25℃，用1 mol/L HCl調節pH值至7.0，8 000 r/min離心10 min，取上清液，用蒸餾水稀釋后采用茚三酮比色法測定水解度。

表1 雙酶復合水解芝麻蛋白Table 1 Compound hydrolysis of sesame protein by double proteases

1.3.1.4 木瓜蛋白酶與風味蛋白酶復合水解芝麻蛋白的單因素試驗

以芝麻蛋白水解度為指標，分別研究底物濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%），pH 值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5），溫度（40、45、50、55、60 ℃），加酶量（1%、2%、3%、4%、5%）對雙酶復合水解芝麻蛋白的影響。水解后得到的芝麻蛋白多肽溶液，經過真空冷凍干燥機凍干成粉末備用。

1.3.1.5 酶解芝麻蛋白水解度的測定

采用茚三酮比色法測定水解度。建立甘氨酸標準曲線：準確稱取甘氨酸0.1 g于錐形瓶中，加入適量蒸餾水溶解均勻，定容到100 mL容量瓶中；取8支試管，分別將甘氨酸標液稀釋至 2、4、6、8、10、15、20 μg/mL。然后分別取上述甘氨酸標準液2 mL于試管中，加入1 mL茚三酮顯色劑，混勻后，100℃水浴鍋中加熱15 min，冷卻至25℃后放置15 min，以空白管調零，在570 nm波長下測定吸光度。以甘氨酸的濃度（μg/mL）為橫坐標，OD值為縱坐標作圖，即得水解度測定的甘氨酸標準曲線，曲線方程為y=0.055 2x-0.025 4，R2=0.997 1。

利用標準曲線可計算水解蛋白液中的游離氨基含量（μmol/mL），然后通過下式計算蛋白水解度（degree of hydrolysis，DH）。

式中：A1、A2為水解液和蛋白溶液測定的吸光值；m為蛋白質質量，mg；MGly為甘氨酸相對分子質量，75.07 g/mol；htot為每克芝麻蛋白所含肽鍵的毫摩爾數，7.6 mmol/g[13]。

1.3.2 芝麻蛋白多肽螯合鈣的制備及分析

1.3.2.1 采用單因素試驗制備芝麻多肽螯合鈣

向50 mL錐形瓶中分別加入一定量的芝麻蛋白多肽與CaCl2，質量比4∶1，加入一定體積蒸餾水，調節pH值為7，在25℃下攪拌1h后5000r/min離心10min，向上清液中加入5倍反應液體積的乙醇，25℃條件下靜置一段時間，待有沉淀生成后以8 000 r/min離心10 min，收集沉淀，用去離子水洗2次后，加入20 mL去離子水制備成多肽-鈣螯合物懸浮液。以鈣螯合率為指標，分別研究芝麻蛋白多肽與氯化鈣質量比（2∶1、3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1、6 ∶1），pH 值（4、5、6、7、8），螯合溫度（25、30、40、50、60 ℃）和螯合時間（20、30、40、50、60 min）對鈣螯合率的影響。

1.3.2.2 芝麻多肽螯合鈣中鈣螯合率測定

乙二胺四乙酸二鈉鹽（ethylene diamine tetraacetic aciddisodium salt，EDTA-2Na）與鈣在堿性條件下形成金屬絡合物，可用于測定樣品中鈣濃度[14]。利用EDTA滴定法，在達滴定終點時，溶液呈現游離指示劑的顏色，根據EDTA用量，可以計算出樣品中鈣的含量。螯合物中鈣含量的測定：吸取1 mL多肽-鈣螯合物懸浮液于試管中，渦旋振蕩均勻后加入1 mL NaOH，再滴加鉻藍黑R3滴～4滴，混合均勻后用0.01 mol/L EDTA標準溶液滴定，根據消耗EDTA的體積，計算出鈣的含量。螯合率的計算方法如下。

1.3.2.3 紅外光譜分析

采用溴化鉀（KBr）壓片法，利用傅里葉變換紅外光譜儀進行紅外掃描，得到芝麻多肽和芝麻多肽螯合鈣的紅外光譜圖。將芝麻蛋白多肽和芝麻蛋白多肽螯合鈣分別與KBr按質量比1∶150混合壓片，掃描范圍為400 cm-1～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為32次。

1.3.3 芝麻蛋白多肽螯合鈣飼喂小鼠應用實驗

1.3.3.1 動物處理

選取三周齡昆明小鼠48只，雌雄各半，將其隨機平均分為6組。A為對照組、B為芝麻多肽-鈣螯合物組、C為葡萄糖酸鈣組、D為碳酸鈣組、E組為抗壞血酸（VC）組，F為芝麻蛋白多肽組。灌胃給藥，每日13：00～14：00灌胃1次，每次藥劑量分別為1 g/kg小鼠體重，其中VC組為0.5 g/kg小鼠體重，對照組為蒸餾水（1 g/kg小鼠體重）。實驗期為28 d[9]，期間喂食常規飼料，自由進食。

1.3.3.2 檢測指標與方法

1）血樣采集：試驗結束后，使用鑷子摘除小鼠眼球進行放血，至小鼠血液放盡后停止，用1.5 mL離心管接血。采集的血液以4 000 r/min離心15 min，取上層血清至離心管中，放置于-20℃冰箱中保存，用于各血清指標的測定。

2）血清鈣的測定：采用血鈣濃度檢測試劑盒檢測。

3）血清堿性磷酸酶的測定：采用組織及血液堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性檢測試劑盒檢測。

4）骨骼采集處理和股骨指標測定：小鼠取血后，剔除小鼠腿部毛發，然后剝去小鼠股骨連附的肌肉組織，取出小鼠的左側股骨，測量其長度和直徑。利用丙酮脫脂處理股骨8 h～10 h后，80℃條件下烘至恒重，稱量股骨干重。根據浮力原理用天平稱重，測量股骨體積，計算單位體積內股骨質量，即骨密度。

5）骨鈣的測定：用硝酸將樣品溶解，再經微波消解，取適量稀釋后的消解液用原子吸收法測鈣含量[15]，計算骨鈣含量。

1.4 數據處理與分析

所有數據采用SPSS 22軟件進行方差分析，顯著差異檢測限P<0.05，應用Origin軟件對試驗數據進行作圖分析，每組試驗樣品測定3次。

2 結果與分析

2.1 芝麻蛋白多肽的制備

2.1.1 蛋白酶組合的篩選

不同蛋白酶水解和雙酶復合水解芝麻蛋白的效果見圖1。

圖1 不同蛋白酶水解和雙酶復合水解芝麻蛋白的效果Fig.1 Effect of different single-protease and double-proteaseson the hydrolysis of sesame protein

由圖1 a可知，在各蛋白酶最適水解條件下，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶的水解度較高，其中單一的中性蛋白酶水解度最高，達到10.53%，而單一堿性蛋白酶水解效果最差，水解度為2%。研究表明，堿性蛋白酶對蛋白質中的羧端疏水氨基酸有較強的專一性，更適合用來酶解堿溶酸沉法制備的植物蛋白[16]。而本研究用DES法提取芝麻蛋白時可能影響到了堿性蛋白酶對芝麻蛋白的專一水解位點，導致其水解度下降。由圖1 b可知，木瓜蛋白酶與風味蛋白酶在不同添加順序條件下復合水解芝麻蛋白的水解度相似，分別為19.82%和20.92%，中性蛋白酶與木瓜蛋白酶不同添加順序下復合水解芝麻蛋白的水解度分別為12.89%和14.00%，風味蛋白酶與中性蛋白酶不同添加順序下復合水解芝麻蛋白的水解度分別為12.58%和13.65%。結果表明，木瓜蛋白酶與風味蛋白酶復合水解芝麻蛋白的效果優于單一蛋白酶和其他蛋白酶的復合水解效果。因此確定最佳酶解條件為同時添加木瓜蛋白酶與風味蛋白酶。

2.1.2 雙酶水解芝麻蛋白的單因素試驗

雙酶水解芝麻蛋白的單因素試驗結果見圖2。

圖2 雙酶水解芝麻蛋白單因素試驗結果Fig.2 Single factor test results of double-proteases hydrolysis of sesame protein

由圖2 a可知，隨著溫度從40℃升高至50℃，芝麻蛋白水解度逐漸提升，當溫度為50℃～60℃時，水解度降低。這是因為木瓜蛋白酶和風味蛋白酶的最適催化溫度均為50℃[17-18]，當溫度逐漸升高時，達到了兩種蛋白酶的最適催化溫度，從而芝麻蛋白的水解度達到最高；當溫度進一步升高時，蛋白酶的空間結構及功能受到影響，活性降低，不利于芝麻蛋白的水解。因此確定最適水解溫度為50℃。由圖2b可知，隨著pH值升高，蛋白水解度呈現出先升高后降低的趨勢，在pH值為6.5～7.0時達到最大；當pH值在7.0～7.5時，水解度呈下降趨勢。這是因為木瓜蛋白酶和風味蛋白酶的最適催化pH值為6和7[19-20]，在最適pH值下，蛋白酶的活性最高，因而芝麻蛋白的水解度最高；當體系的pH值偏離最適pH值時，蛋白酶的活性降低，不利于芝麻蛋白的水解。因此確定最佳水解pH值為6.5。由圖2c可知，當底物濃度從0.5%升高至2.5%，水解度呈先升高后降低的趨勢。當底物濃度較小時，提高底物濃度，酶與底物接觸概率變大，水解度增加；當底物濃度過大時，酶解體系的黏度高，導致部分底物不能與酶接觸，并且部分酶被底物包裹，從而使芝麻蛋白水解度受到影響。因此選擇最佳底物濃度為1.0%。由圖2d可知，加酶量在1%到3%時，水解度明顯增加，當加酶量在3%到5%時，水解度變化不大。當酶的濃度較低時，提高加酶量，會使酶與底物接觸概率增加，從而使水解度增大；進一步提高加酶量，達到了底物飽和的最大酶濃度，芝麻蛋白的水解度不再提高，因此確定加酶量為3%。在各單因素最適條件下，水解度最高位21.09%。

2.2 芝麻蛋白多肽螯合鈣的制備

2.2.1 芝麻蛋白多肽螯合鈣制備的單因素試驗

芝麻蛋白多肽螯合鈣制備的單因素試驗結果見圖3。

圖3 芝麻蛋白多肽螯合鈣制備的單因素試驗結果Fig.3 Single factor test results of the preparation of sesame protein peptide chelated calcium

由圖3a可知，隨著多肽與氯化鈣質量比從2∶1提升至5∶1時，螯合率也隨之升高，并達到最大值；繼續增大多肽質量，螯合率提升不大。這是因為當多肽與氯化鈣的質量比較小時，大部分鈣離子未參與螯合。隨著多肽與氯化鈣的質量比的增大，螯合率達到最高值，繼續增大多肽質量，由于此時多肽濃度已達飽和，螯合率不再繼續提升。初步確定多肽與氯化鈣質量比為5∶1作進一步優化。由圖3b可知，螯合時間為20 min時，螯合率已達到67%，可見螯合反應是一個較為迅速的反應。繼續增加螯合時間，螯合率不再提升，因此確定螯合時間為20 min。如圖3c所示，當pH值從4增加到7時，螯合率逐漸上升，當pH7時螯合率最高，達到72%，繼續增大pH值，螯合率下降。可見pH值對螯合率的影響較大，過酸或過堿都不利于多肽-鈣螯合物的形成。原因可能是當H+大量存在時，H+會與Ca2+競爭供電子基團，羧基配位能力較弱，不利于螯合物的形成[21]；當OH-存在時，Ca2+會與其生成Ca（OH）2沉淀；在中性條件下，配體受 H+和 OH-較小，提供了充分的供電子基團，有利于與Ca2+通過配位鍵形成螯合物。因此確定最佳螯合pH值為7。如圖3d所示，隨著螯合溫度的升高，螯合率逐漸增加，在40℃時最高；當螯合溫度繼續增加時，螯合率呈下降趨勢。當螯合溫度較低時，螯合反應速度慢，螯合率較低；因此適當提高溫度能提高多肽與Ca2+碰撞的概率，提高螯合率。由于多肽與金屬離子的螯合是一個放熱反應，螯合溫度過高不利于螯合反應的進行，同時高溫可能會導致多肽發生羰氨反應，減少Ca2+螯合位點。因此確定最佳螯合溫度為40℃。張磊等[22]利用鹿骨膠原多肽制備多肽螯合鈣，在pH 6、酶解液與氯化鈣溶液體積比2∶1、螯合溫度40℃，螯合時間50 min條件下，最大螯合率為51.6%。周小敏等[23]制備了金槍魚骨膠原多肽螯合鈣，在pH 6.0、溫度55℃、螯合時間40 min、膠原多肽與氯化鈣質量比1∶1的條件下，最高螯合率達到88%。本研究制備的芝麻多肽螯合鈣在多肽與氯化鈣質量比為5∶1，pH7.0，螯合溫度40℃，螯合時間20 min條件下，最大螯合率為75%。這些結果表明不同種類的蛋白多肽制備的多肽螯合鈣螯合率有較大差距，多肽的種類對螯合率有較大影響。

2.2.2 芝麻蛋白多肽螯合鈣紅外光譜分析

多肽和多肽螯合物的紅外光譜見圖4。

圖4 多肽和多肽螯合鈣的紅外光譜Fig.4 FTIR spectra of peptide and peptidechelated calcium

由圖4可以看出，芝麻蛋白多肽在與鈣螯合后，整個波形發生了移動。在特征區，氨基（N-H）的伸縮振動峰由3 428 cm-1移到3 410 cm-1，說明芝麻蛋白多肽的N-H鍵發生了化學變化，可能是由于N-H與Ca2+配位引起N-H拉伸和氫鍵被取代。C=O的吸收峰在1 651 cm-1，而多肽螯合鈣吸收峰藍移至1 643 cm-1；-COO-的吸收峰在1 411 cm-1，多肽螯合鈣的吸收峰紅移至1 377 cm-1，可能是由于Ca2+與-COO-反應形成-COOCa[24]，說明氨基和羧基均參與了螯合反應。這些現象說明鈣與多肽的C=O、N-H和-COO-結合，形成了穩定的多肽螯合鈣。

2.3 芝麻蛋白多肽螯合鈣的小鼠灌胃實驗

2.3.1 小鼠股骨計量學變化

各組小鼠股骨指標結果見表2。

表2 各組小鼠股骨指標Table 2 Femur indexes of rats in each group

股骨的狀況間接反映了全身的骨骼狀況，骨密度是用于評價骨質疏松癥和骨折危險度的重要指標[25]。由表2可以看出，服用多肽螯合鈣（B）組小鼠在股骨質量、長度和密度方面均高于服用葡萄糖酸鈣（C）、碳酸鈣（D）、VC（E）和對照組（A）。表明芝麻蛋白多肽螯合鈣不僅具有較好的補鈣效果，而且在促進小鼠股骨生長，提高股骨密度的效果優于傳統的補鈣劑葡萄糖酸鈣、碳酸鈣和VC。

2.3.2 小鼠股骨和血液中鈣含量變化

各組小鼠骨鈣和血鈣含量見圖5。

圖5 各組小鼠骨鈣和血鈣含量Fig.5 Bone calcium and blood calcium content of rats in each group

骨鈣的含量是決定骨密度的重要因素[26]。由圖5a可以看出，服用多肽螯合鈣（B）、葡萄糖酸鈣（C）和碳酸鈣（D）的小鼠骨鈣含量均高于對照組（A）、VC（E）和芝麻蛋白多肽（F），而且，服用多肽螯合鈣（B）的小鼠骨鈣含量最高，表明服用芝麻蛋白多肽螯合鈣能明顯增加小鼠股骨中鈣含量，其補鈣效果優于葡萄糖酸鈣和碳酸鈣。

血清鈣含量受腸道對鈣的吸收、骨鈣融出以及甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）[27]、降鈣素[28]等激素調節的影響。鈣的有效補充可以維持正常血鈣水平，抑制PTH水平的增加，血鈣降低說明鈣未得到有效吸收，出現鈣平衡失調，因此血鈣的含量可以用來評價補鈣劑在小鼠體內的吸收利用情況。由圖5b可以看出，服用多肽螯合鈣（B）、葡萄糖酸鈣（C）和碳酸鈣（D）的小鼠血液中的鈣含量均高于對照組（A）、VC（E）和芝麻蛋白多肽（F），而且，服用多肽螯合鈣（B）的小鼠血鈣含量最高，表明服用芝麻蛋白多肽螯合鈣能明顯增加小鼠血液中的鈣含量。

2.3.3 小鼠血清AKP活性變化

各組小鼠血清AKP活性見圖6。

圖6 各組小鼠血清AKP活性Fig.6 Serum AKP activity of rats in each group

血清中的AKP主要來自骨骼，是成骨細胞的產物和反映骨代謝的重要指標[29-30]。當成骨細胞變為骨細胞時，血清AKP含量減小，活性下降。并且在一些疾病狀態時AKP釋入血清，使血清AKP含量和活性增加。由圖6可以看出，服用多肽螯合鈣（B）、葡萄糖酸鈣（C）和碳酸鈣（D）的小鼠血液中的AKP活性均低于對照組（A）、VC（E）和芝麻蛋白多肽（F），表明芝麻蛋白多肽螯合鈣、葡萄糖酸鈣和碳酸鈣均可以有效降低血清AKP活性，對股骨鈣化具有促進作用。

3 結論

本研究所得芝麻蛋白的最佳水解條件為采用木瓜蛋白酶與風味蛋白酶復合水解、溫度50℃、pH6.5、底物濃度1%、加酶量3%，在此條件下水解度最高為21.09%。制備芝麻蛋白多肽螯合鈣的最佳螯合工藝：多肽與CaCl2的質量比5∶1、溫度40℃、pH7.0、螯合時間20 min，在此條件下，多肽鈣螯合率最高達到75%。通過對芝麻蛋白多肽和芝麻蛋白多肽螯合鈣的傅里葉紅外光譜圖進行分析發現鈣與多肽的C=O處及末端的N-H和-COO-處結合，表明芝麻蛋白多肽和鈣成功發生了螯合。通過小鼠灌胃實驗發現，與對照組（蒸餾水灌胃）相比，芝麻蛋白多肽螯合鈣對小鼠股骨生長有促進作用，提高了骨鈣含量，且效果優于葡萄糖酸鈣和碳酸鈣；提高了小鼠體內血鈣含量，降低了堿性磷酸酶（AKP）活性。本研究為芝麻蛋白及其鈣補充劑的開發利用提供了科學依據。