低共熔溶劑提取靈芝多糖的工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

謝苗，亓小妮，張?chǎng)危瑒B(yǎng)山，張景，杜秀菊

（聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252059）

靈芝（Ganoderma lucidum）即靈芝子實(shí)體，是藥食兩用真菌，在中國(guó)藥典中歷史悠久，被歷代醫(yī)藥世家視為滋補(bǔ)強(qiáng)身、扶正固本的草本植物[1]。靈芝富含靈芝多糖、靈芝酸（主要為三萜類）、腺苷、甾醇、生物堿等多種有效成分[2]，具有提高機(jī)體免疫力、抗衰老、抗腫瘤、助眠等功效。

以水煎服中草藥即主要攝取其中的多糖成分，傳統(tǒng)的靈芝多糖的提取方法為熱水浸提法，但是其耗能耗時(shí)且得率不高，而酸堿提取有可能會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)，超聲、微波輔助提取等則需要借助專業(yè)的儀器且不利于大規(guī)模提取[3]。在天然產(chǎn)物提取的過(guò)程中，綠色化學(xué)概念盛行，然而一些離子試劑雖應(yīng)用效果好，但是價(jià)格昂貴，不利于普遍應(yīng)用。因此，尋求價(jià)廉、高效、環(huán)保且實(shí)用性強(qiáng)的方法對(duì)提取天然活性成分具有重大意義，發(fā)展前景廣闊。

低共熔溶劑（deeep eutectic solvents，DESs），是一種由氫鍵受體和氫鍵供體形成的離子復(fù)合物溶液，具有價(jià)格低廉、易獲取、易合成、綠色環(huán)保可降解、無(wú)毒害、揮發(fā)性低等優(yōu)點(diǎn)[4]。本文選用5種DESs提取靈芝多糖（Ganoderma lucidum polysaccharide，GLP）以篩選出最適合的溶劑并結(jié)合Box-Behnken中心組合試驗(yàn)優(yōu)化提取方式，對(duì)最優(yōu)DESs-5即氯化膽堿-尿素（choline chloride-Urea，ChCl-Urea）試劑提取的靈芝多糖（Ganoderma lucidum polysaccharide choline chloride-Urea，GLP-5）和常規(guī)水提靈芝多糖（Ganoderma lucidum polysaccharide-W，GLP-W）進(jìn)行得率及抗氧化活性比較。本試驗(yàn)為靈芝多糖的提取探索一條綠色且高效的道路，為靈芝多糖的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝子實(shí)體粉：山東省聊城市冠縣博益德靈芝有限公司；甜菜堿、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、甘油、氯化膽堿、尿素（均為分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無(wú)水乙醇、濃硫酸、苯酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、硫酸亞鐵、30%過(guò)氧化氫、水楊酸（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；DPPH、抗壞血酸（VC）（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力加熱攪拌器（78-1）：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HHS）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（HPX-9052MBE）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；離心機(jī)（Sorvall Stratos）：德國(guó) Thermo Fisher公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000B）：上海亞榮生化儀器廠；可見(jiàn)分光光度計(jì)（WF-J2100）：上海佑科儀器儀表有限公司；冷凍干燥機(jī)（DC801）：重慶雅馬拓科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預(yù)處理

靈芝子實(shí)體粉烘干至恒重，按照液料比為20∶1（mL/g）的比例加入95%乙醇浸泡24 h，以除去脂類及小分子雜質(zhì)，重復(fù)兩次，離心得濾渣烘干備用。

1.3.2 DESs試劑的制備

將所需試劑提前干燥后按照氫鍵供體與氫鍵受體以合適的摩爾比稱量，然后混合置于80℃電熱恒溫水浴鍋內(nèi)加熱至大部分試劑熔化[5]，再轉(zhuǎn)移至磁力加熱攪拌器上不斷攪拌獲得均一液體，即為低共熔溶劑。不同DESs溶劑的合成及摩爾比見(jiàn)表1。

表1 不同DESs溶劑的合成及摩爾比Table 1 Synthesis and molar ratios of different DESs solvents

1.3.3 靈芝多糖的提取

根據(jù)熊蘇慧等[7]的方法提取多糖，略有改動(dòng)。稱取1 g預(yù)處理后的靈芝子實(shí)體粉，按照一定的料液比與DESs溶劑攪拌均勻，置于合適的條件下進(jìn)行提取，離心（7 656×g，20 min）、抽濾、定容、醇沉得沉淀物加蒸餾水溶解，依照苯酚-硫酸法[11]測(cè)定多糖得率。DESs-1、DESs-2、DESs-3、DESs-4 和 DESs-5 試劑所對(duì)應(yīng)的多糖分別命名為GLP-1、GLP-2、GLP-3、GLP-4和GLP-5。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

按照1.3.3中低共熔溶劑法提取靈芝多糖的方法，以多糖得率為指標(biāo)，固定其它條件，分別考察提取時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h），醇沉?xí)r間（2.0、6.0、12.0、18.0、24.0 h），DESs-5 含量 （10.0%、30.0%、50.0%、70.0%、90.0%）3個(gè)單因素對(duì)靈芝多糖得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)，采用三因素三水平（A DESs-5含量、B提取時(shí)間、C醇沉?xí)r間）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察多糖得率變化，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

1.3.6 抗氧化試驗(yàn)

DPPH自由基清除能力的測(cè)定根據(jù)Du等[12]和吳楊洋等[13]的方法進(jìn)行測(cè)定；羥基自由基清除試驗(yàn)根據(jù)田淑雨等[14]的方法進(jìn)行測(cè)定；還原力測(cè)定根據(jù)鹿士峰等[15]的方法進(jìn)行測(cè)定。略有改動(dòng)。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels in response surface design

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有的試驗(yàn)均重復(fù)3次取平均值，使用IBM SPSS Statistics 21和Design Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DESs試劑篩選結(jié)果

不同DESs溶劑對(duì)靈芝多糖得率的影響見(jiàn)圖1，不同多糖的羥基自由基清除率見(jiàn)圖2。

圖1 不同DESs溶劑對(duì)靈芝多糖得率的影響Fig.1 The effects of different DESs solvents on yield of GLP

圖2 不同多糖的羥基自由基清除率Fig.2 The hydroxyl radical scavenging rate of polysaccharides of different polysaccharides

由圖1和圖2可知，在5種DESs試劑中GLP-5得率最高且清除羥基自由基能力尤為顯著，因此選定DESs-5作為最適合的低共熔溶劑提取靈芝多糖并進(jìn)行工藝優(yōu)化。

2.2 單因素試驗(yàn)

不同因素對(duì)GLP-5得率的影響見(jiàn)圖3。

由圖3（a）可知，在1.5 h～2.0 hGLP-5得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低，在2 h時(shí)GLP-5得率最高。這可能是由于前期隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖不斷滲入提取液，致使得率增加[16]，而到達(dá)一定時(shí)間多糖的得率最高，時(shí)間再加長(zhǎng)反而會(huì)破壞多糖成分。因此，本試驗(yàn)選定提取時(shí)間1.5、2 h和2.5 h進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

如圖3（b）所示，在2 h～6 hGLP-5得率隨著醇沉?xí)r間的延長(zhǎng)而增加，但在6 h～18 h，GLP-5得率不斷下降，這可能是醇沉?xí)r間過(guò)長(zhǎng)致使部分多糖失活[17]。本試驗(yàn)選擇2.0、6.0 h和12.0 h進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

由于DESs試劑是由兩種及兩種以上的有機(jī)物混勻熔化而得，通常試劑的內(nèi)部離子力較強(qiáng)且黏度較大[18]，所以在使用過(guò)程中一般會(huì)加入一定比例的蒸餾水來(lái)降低溶液的剪切力。如圖3（c）所示，30%的DESs-5更利于GLP-5提取，90%的DESs-5提取并抽濾之后靜置會(huì)出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，會(huì)對(duì)后續(xù)醇沉造成影響，所以選擇10.0%、30.0%、50.0%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在DESs-5提取靈芝多糖（GLP-5）的過(guò)程中，以A DESs-5含量、B提取時(shí)間、C醇沉?xí)r間為影響因素，多糖得率作為響應(yīng)值。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 The designs and results of Box-Behnken test

2.3.2 模型建立與方差分析

采用響應(yīng)面分析軟件，對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合和顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 The regression model of variance analysis results

根據(jù)表4可得擬合回歸方程為Y=0.99+0.083A-0.005 515B+0.034C+0.046AB+0.023AC+0.008 603BC-0.17A2-0.13B2-0.099C2。模型差異極顯著（P=0.000 1<0.001），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.199 2>0.05），這表明模型的擬合度極好；模型R2=0.972 3，表明模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合度較好；模型校正系數(shù)R2Adj=0.936 7，表明該模型可以解釋93.67%響應(yīng)值的變化，能夠用該模型對(duì)靈芝子實(shí)體多糖得率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。C.V.%=4.54%<10%，表明試驗(yàn)可信度和精確度高。

模型一次項(xiàng)A（P=0.000 4）、二次項(xiàng)A2（P<0.000 1）、B2（P=0.000 1）達(dá)到極顯著（P<0.01）的水平，一次項(xiàng)C（P=0.031 8）、二次項(xiàng)AB（P=0.0374）、C2（P=0.001 1）達(dá)到顯著水平。

2.3.3 響應(yīng)面分析

不同因素對(duì)GLP-5得率的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖4。

圖4 不同因素交互作用對(duì)GLP提取得率的影響Fig.4 The effects of different factors interaction on the extraction yield of GLP

由圖 4可知，DESs-5含量（A）和提取時(shí)間（B）的交互作用的響應(yīng)面曲線最陡，說(shuō)明DESs-5含量和提取時(shí)間之間二次交互對(duì)靈芝多糖得率的影響最為顯著[19]；DESs-5含量（A）和醇沉?xí)r間（C）曲面陡峭程度次之，提取時(shí)間（B）和醇沉?xí)r間（C）曲面陡峭程度最弱；由等高線同樣可以看出，DESs-5含量（A）和提取時(shí)間（B）交互作用最顯著，提取時(shí)間（B）和醇沉?xí)r間（C）之間的交互作用最小[20]。結(jié)果表明，因素間交互作用對(duì)靈芝多糖得率的影響順序?yàn)锳B＞AC＞BC。此外，根據(jù)F值大小可以判斷各單因素對(duì)靈芝多糖提取的顯著性排序：A＞C＞B，即DESs-5含量＞醇沉?xí)r間＞提取時(shí)間。

2.3.4 響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)值驗(yàn)證

通過(guò)回歸模型的分析，獲得GLP-5最佳提取工藝條件為DESs-5含量34.22%，提取時(shí)間1.91 h，醇沉?xí)r間7.26 h，靈芝多糖的預(yù)測(cè)提取得率為1.00%。為檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，根據(jù)上面優(yōu)化條件，同時(shí)為了方便實(shí)際操作，重新調(diào)整提取時(shí)間1.9 h，DESs-5含量34%和醇沉?xí)r間7.3 h，實(shí)際提取得率為1.10%，與理論值誤差為0.10%。

采用水作為提取試劑，其他條件與GLP-5的提取條件保持一致，即常規(guī)熱水浸提法獲得的靈芝多糖GLP-W（得率0.60%）相比，采用該方法提取的靈芝多糖GLP-5得率提高了83.33%。

2.4 抗氧化結(jié)果分析

2.4.1 DPPH自由基清除率

不同多糖的DPPH自由基清除率見(jiàn)圖5。

圖5 不同多糖的DPPH自由基清除率Fig.5 The DPPH radical scavenging rate of polysaccharides of different polysaccharides

由圖5可知，在樣品濃度為2 mg/mL時(shí)GLP-5的清除率為59.37%，與GLP-W（49.27%）相比DPPH自由基的清除率提高了20.50%。該數(shù)據(jù)表明DESs-5提取的GLP-5的DPPH自由基清除活性較強(qiáng)，且隨著濃度的增加DPPH自由基清除活性也不斷提高。

2.4.2 羥基自由基清除率

不同多糖的羥基自由基清除率見(jiàn)圖6。

圖6 不同多糖的羥自由基清除率Fig.6 The hydroxyl radical scavenging rate of polysaccharides of different polysaccharides

由圖6可知，羥基自由基的清除率高低順序?yàn)镚LP-W>GLP-5，這表明常規(guī)熱水浸提獲得的多糖清除羥基自由基能力比以氯化膽堿-尿素為低共熔溶劑提取的多糖能力強(qiáng)。此外，羥基自由基的清除率隨樣品濃度的增加而提高，說(shuō)明兩者呈明顯的量效關(guān)系。

2.4.3 還原力的測(cè)定

不同多糖的還原力見(jiàn)圖7。

圖7 不同多糖的還原力Fig.7 The reducing power scavenging activity of polysaccharides of different polysaccharides

由圖7得知，還原力高低順序?yàn)椋篏LP-5>GLP-W，在樣品濃度為2 mg/mL時(shí)GLP-5的還原力與GLP-W相比提高了47.47%。結(jié)果表明，DESs-5提取的多糖在還原力方面優(yōu)于水提多糖，而且還原力隨GLP-5濃度的增加而增加，表明兩者呈正相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論

本文對(duì)比了5種DESs溶劑結(jié)果表明，氯化膽堿-尿素提取多糖得率較高且羥基自由基的清除能力最好。進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)得到GLP-5的最優(yōu)提取工藝為DESs-5含量34%，提取時(shí)間1.9 h，醇沉?xí)r間7.3 h，靈芝多糖的提取得率1.10%，比常規(guī)熱水浸提法提高了83.33%。抗氧化試驗(yàn)表明：GLP-5具有一定的抗氧化活性，且呈劑量活性相關(guān)性。GLP-5的DPPH自由基清除率和還原力均優(yōu)于GLP-W，分別提高了20.50%和47.47%。DESs與其他離子試劑相比較，不僅價(jià)格低廉易制備，而且綠色環(huán)保易于回收。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，采用低共熔溶劑法制備靈芝多糖，不僅提高了提取率，抗氧化活性也有顯著提升，值得進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。