普洱茶（生茶）0至10年倉儲陳化過程中的化學成分變化

馬冰凇，徐成成，任小盈，王家菜，馬存強，周斌星*

（1.云南農業大學龍潤普洱茶學院，云南 昆明 650201；2.聊城高級財經職業學校，山東 聊城 252000；3.華中農業大學園藝林學學院，湖北 武漢 430070）

普洱茶是以云南大葉種[Camellia sinensis var.assamica（JW Masters）Kitamura]曬青綠茶為原料加工而成的一種后發酵茶葉類型[1]，按照加工工藝分為普洱茶（生茶）和普洱茶（熟茶）[2]。由于普洱茶（生茶）直接由曬青綠茶經蒸壓而成，品質和化學成分與曬青綠茶相似。在普洱茶渥堆發酵和倉儲陳化過程中化學成分均發生顯著變化[3-4]。大量研究證實了渥堆發酵工藝導致普洱茶（生茶）和普洱茶（熟茶）之間酚類物質、氨基酸、揮發性成分差異顯著[5-6]。研究人員[7-9]借助代謝組學、蛋白質組學、微生物組學等現代研究手段揭示了普洱茶渥堆發酵中化學成分的變化規律及其與微生物群落的相互關系。然而，普洱茶倉儲陳化中的化學成分變化研究較為匱乏。

除了在渥堆發酵中檢出黑曲霉（Aspergillus niger）、塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）和溫特曲霉（Aspergillus wentii）等優勢真菌，普洱茶倉儲陳化樣中發現多種細菌、放線菌和真菌菌群[10-11]。由此可知，普洱茶等黑茶的倉儲陳化在一定程度上可視為微生物參與的后發酵過程。Zhou等[12]在普洱茶（熟茶）中分離出多株類似金花菌的曲霉屬真菌，如Aspergilluspallidofulvus和Aspergillussesamicola等。茶葉微生物發酵證實：A.pallidofulvus、A.sesamicola等茶源真菌對茶葉的酚類成分代謝均有深刻影響[13]。另有研究顯示倉儲環境影響普洱茶中的兒茶素、氨基酸、酚酸、黃酮類、黃酮醇苷、溶血卵磷脂等代謝組分[14]。

酚類物質是茶葉中主要呈味物質和功效成分[15]，具有抗氧化、抗炎特性以及降低癌癥和糖尿病幾率、降血脂和抗肥胖等多種生物活性，主要包括兒茶素類、黃酮醇類、黃酮類、酚酸類和花青素類等[16]，其含量占茶樹鮮葉干物質的18%～36%[17]。本文采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）等方法對0至10年等不同倉儲時間普洱茶（生茶）中的酚類、嘌呤堿、可溶性糖和游離氨基酸等主要化學成分進行測定，并對普洱茶（生茶）新茶、陳茶和老茶進行分組比較，為倉儲陳化中普洱茶的分類比較提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 材料

茶祖系列普洱茶（生茶）：2009至2019年由云南茶祖茶業有限公司采用同一配方生產，云南普洱市倉儲陳化，根據陳化時間（0至10年）命名為CZ-0至CZ-10；大荒系列普洱茶（生茶）：2009至2019年宏偉生態茶廠采用同一規格大荒茶樹鮮葉加工生產，云南景洪市倉儲陳化，根據陳化時間（0至10年）命名為DH-0至DH-10。樣品收集完成后，密閉封存，在-20℃保存。

兒茶素（catechin，C）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、沒食子酸等標準品（純度≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；槲皮素、山奈酚、楊梅素、蘆丁等黃酮類標準品（純度≥98%）：成都曼斯特生物科技有限公司；咖啡堿、可可堿標準品（純度≥98%）、蒽酮（ACS試劑）、茚三酮（ACS試劑）：美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈（均為色譜級）：美國Thermo Fisher公司。其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Heraeus Fresco17高速離心機：美國Thermo Fisher公司；SCQ-Y300A超聲波恒溫水浴：上海聲彥超聲波儀器公司；JXFSTPRP-24研磨儀：上海凈信科技有限公司；TU-1901紫外-可見分光光度計：北京普析技術有限公司；1200型HPLC儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 主要化學成分分析

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》和GB/T 8305—2013《茶水浸出物測定》進行茶葉中水分和水浸出物的測定。以沒食子酸為參照，采用福林酚試劑在765 nm波長下進行茶葉中的茶多酚含量測定[18-19]。采用蒽酮試劑在620 nm波長下測定茶葉中可溶性糖總量[19]。游離氨基酸總量測定采用570 nm波長下的茚三酮比色法[20]。

1.3.2 茶湯浸提

普洱茶（生茶）茶樣經研磨儀研磨過40目篩后，稱取1.0 g茶葉研磨樣品，加入40 mL甲醇和4 mL鹽酸于圓底燒瓶85℃回流浸提90 min，冷卻過濾后，用甲醇定容至50 mL，過0.45 μm尼龍濾膜后用于HPLC檢測。

1.3.3 酚類與嘌呤堿含量的HPLC檢測

參照Nian等[21]構建的茶葉中活性成分的HPLC檢測方法，采用Agilent1200型HPLC儀連接Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和C18保護柱（10 mm×4.6 mm，5 μm）進行HPLC檢測。流動相A為0.261%磷酸、5%乙腈，流動相B為80%甲醇。采用洗脫梯度程序：0至16 min，流動相B從10%線性增加至45%；16 min至22 min，流動相B從45%線性增加至65%；從22 min至25.9 min，流動相B保持65%；從25.9 min至29.0 min，流動相B線性增加至100%；從29 min至30 min，流動相B保持100%。柱溫為35℃；0～16 min檢測波長為280 nm；16 min～30 min檢測波長為360 nm；進樣體積為2 μL。平衡運行6 min后進行下一步測定。

1.3.4 數據處理與分析

每個茶樣進行3次測定重復。數據采用平均值±標準差表示。采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANOVA）。采用Origin 9.0軟件進行數據的歸一化處理和熱力圖的繪制以及主成分分析（principal component analysis，PCA）和層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）。

2 結果與分析

2.1 普洱茶（生茶）倉儲陳化中的化學成分變化

7種兒茶素、4種黃酮類、2種嘌呤堿和沒食子酸等標準品的高效液相色譜（HPLC）圖譜如圖1所示，結合相關標準曲線進行普洱茶（生茶）中酚類、嘌呤堿等活性成分的定量分析。

圖1 7種兒茶素、4種黃酮類、沒食子酸和2種嘌呤堿等標準品的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 7 catechins，4 flavonoids，gallic acid and 2 purine alkaloids

普洱茶（生茶）0至10年倉儲陳化過程中兒茶素、沒食子酸、黃酮類等化學成分的變化規律見圖2和表1。

圖2 普洱茶（生茶）倉儲陳化中化學成分的變化Fig.2 Changes of chemical components in Pu-erh raw tea during the storage and aging

熱力圖分析（圖2）揭示了ECG、EGCG、GCG和EGC等兒茶素以及游離氨基酸含量呈降低趨勢；而可溶性糖、沒食子酸、楊梅素、蘆丁等成分整體呈增加趨勢。另外，咖啡堿、可可堿等嘌呤堿含量在倉儲陳化中保持基本穩定，而EC和C等非酯型兒茶素呈先增加后減少的變化趨勢。由表1可知，酯型兒茶素總量在普洱茶（生茶）倉儲陳化中呈下降趨勢；在倉儲陳化中非酯型兒茶素總量保持相對穩定，在倉儲陳化初期（0至5年）變化不明顯，倉儲陳化5年后呈下降趨勢。普洱茶（生茶）倉儲陳化中楊梅素和沒食子酸含量呈增加趨勢。C、EC、GC、EGC等非酯型兒茶素在倉儲陳化中均呈先增加后減小的變化趨勢；山奈酚、楊梅素等黃酮類含量整體呈增加趨勢。普洱茶（生茶）倉儲陳化中部分兒茶素和游離氨基酸含量變化規律與前期研究結果相似[14，22]。本研究首次發現，山奈酚和楊梅素含量在普洱茶（生茶）倉儲陳化過程中均呈增加趨勢，而槲皮素保持基本穩定。Wang等[23]研究發現在普洱茶倉儲陳化中槲皮素、蘆丁以及黃酮糖苷，如山奈酚-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷和楊梅素-3-葡萄糖苷呈降低趨勢，可能與倉儲環境等因素有關。相對濕熱

的倉儲環境中有利于山奈酚、楊梅素和蘆丁等黃酮類化合物的累積[14，17]。

表1 0至10年內不同陳化時間普洱茶（生茶）中的主要化學成分含量Table 1 Contents of main chemical components in Pu-erh raw tea with a storage time from 0 to 10 years

咖啡堿、可可堿和槲皮素在普洱茶（生茶）倉儲陳化中無顯著性變化（P>0.05）。這與Wang等[23]和Zhou等[17]研究結果一致。而Xu等[14]研究顯示咖啡堿含量在倉儲陳化過程中呈下降趨勢。普洱茶（生茶）倉儲陳化過程中沒食子酸含量明顯增加，與Ku等[24]研究結果一致。沒食子酸和非酯型兒茶素增加與酯型兒茶素降低存在潛在關聯。在茶葉微生物發酵中，冠突散囊菌（Eurotium cristatum）[25]、A.sesamicola 和 A.pallidofulvus能分泌相關的酶催化酯型兒茶素水解產生相應的非酯型兒茶素和沒食子酸[13-14]。普洱茶（生茶）倉儲陳化中沒食子酸可能主要來自于酯型兒茶素的水解。酯型兒茶素通過進一步的水解、氧化、聚合等一系列反應形成茶黃素、茶紅素和茶褐素等茶色素。

2.2 不同倉儲陳化期普洱茶（生茶）的PCA和HCA

采用PCA和HCA對存儲時間0至10年的普洱茶（生茶）進行分組比較，結果見圖3。

圖3 不同存儲時間普洱茶（生茶）的PCA和HCAFig.3 PCA and HCA for Pu-erh raw teas with various storage time

如圖3A所示，主成分1和主成分2分別解釋了總方差的56.3%和26.8%，揭示了茶祖和大荒兩個系列以及同一系列不同陳化期普洱茶（生茶）之間的顯著差異。PCA將同系列普洱茶（生茶）茶樣分為新茶（2年內）、陳茶（3至7年）和老茶（8年以上）3組，顯示了普洱茶（生茶）倉儲陳化過程中化學成分的階段性變化規律。HCA（圖3B）同樣顯示了大荒和茶祖兩系列以及同一系列不同倉儲期普洱茶（生茶）之間的顯著差異。總體來說，陳化8年以上和陳化8年以內的普洱茶（生茶）在化學成分上存在明顯差異。因此，將陳化8年及其以上的普洱茶（生茶）歸為老茶，有科學依據，也符合消費者的基本認知。由于曬青綠茶等原料以及蒸壓工藝差異，不同系列普洱茶（生茶）中的茶多酚、兒茶素、氨基酸等化學成分存在差異。因此，現階段基于茶多酚、兒茶素等主要化學成分含量及其變化完成對普洱茶（生茶）存儲時間的識別依然存在技術缺陷，有待進一步提高完善。

2.3 普洱茶（生茶）新茶、陳茶、老茶之間的化學成分差異

新茶、陳茶、老茶等不同陳化期普洱茶（生茶）中的主要化學成分含量如表2所示。

表2 不同茶組普洱茶（生茶）中的主要化學成分含量差異Table 2 Differences of main quality components among various groups of Pu-erh raw tea

續表2 不同茶組普洱茶（生茶）中的主要化學成分含量差異Continue table 2 Differences of main quality components among various groups of Pu-erh raw tea

如表2所示，新茶、陳茶和老茶等不同倉儲期普洱茶（生茶）在茶多酚、游離氨基酸總量、5種兒茶素（EGC、GC、ECG、GCG和EGCG）和沒食子酸成分上均存在極顯著差異（P<0.01），新茶與老茶組C、山奈酚和楊梅素存在極顯著差異（P<0.01），而可溶性糖、槲皮素、蘆丁、咖啡堿和可可堿無顯著差異（P>0.05）。另外，陳茶與老茶組EC僅在P<0.05水平存在顯著性差異，而普洱茶（生茶）倉儲陳化中水浸出物顯著降低（P<0.05），其在新茶中含量最高。相對而言，普洱茶（生茶）新茶中茶多酚、兒茶素和游離氨基酸含量最高，而普洱茶（生茶）老茶中沒食子酸和黃酮總量最高。普洱茶（生茶）陳茶中茶多酚、游離氨基酸、兒茶素、黃酮類、沒食子酸含量介于新茶和老茶之間。不同倉儲期普洱茶（生茶）6種兒茶素、2種黃酮類化合物和沒食子酸含量的極顯著性（P<0.01）差異為普洱茶（生茶）的新茶、陳茶和老茶的判別提供了科學依據。普洱茶（生茶）倉儲陳化中山奈酚和楊梅素的增加可能主要來自于相關黃酮糖苷的水解。茶多酚、兒茶素、游離氨基酸的極顯著（P<0.01）降低可能主要用于茶褐素等茶色素的合成[26]。

3 結論

采用HPLC和紫外-可見分光光度計法對兩個系列（茶祖和大荒）存儲時間0至10年的普洱茶（生茶）中兒茶素、黃酮類、沒食子酸、嘌呤堿、可溶性糖、游離氨基酸等化學成分進行測定，結果表明，普洱茶（生茶）倉儲陳化過程中茶多酚、游離氨基酸、酯型兒茶素（ECG、GCG和EGCG）含量呈降低趨勢；楊梅素和沒食子酸含量整體呈增加趨勢。而C、EC、GC和EGC等非酯型兒茶素和山奈酚整體呈先增加后減少趨勢。另外，咖啡堿、可可堿等嘌呤堿以及可溶性糖和槲皮素無顯著性變化（P>0.05）。PCA和HCA根據普洱茶（生茶）倉儲陳化中化學成分的階段性變化將同系列普洱茶（生茶）分為新茶（0年至2年）、陳茶（3至7年）和老茶（8年及其以上）3組。單因素方差分析顯示了普洱茶（生茶）新茶、陳茶、老茶在茶多酚、游離氨基酸、6種兒茶素、2種黃酮類成分和沒食子酸等品質成分上的極顯著差異（P<0.01），為倉儲陳化中普洱茶（生茶）的分類識別提供了一定參考。