二氫楊梅素-銀離子乳液抗白色念珠菌的研究

周正偉，黃權鋒，孫建霞，彭林，劉丹*

（1.廣東工業大學輕工化工學院，廣東 廣州 510006；2.北京理工大學珠海學院材料與環境學院，廣東 珠海 519088）

白色念珠菌作為一種雙形態（圖1）的條件致病菌[1-2]，可定植于生物體表面形成生物被膜[3]。根據詹洪洪等[4]研究發現，白色念珠菌菌絲態和生物被膜態的形成和發展與白色念珠菌的致病能力息息相關。已有研究報道目前普遍使用的抗生素類藥物對生物被膜的清除能力差，致使其產生耐藥性[5]，基于此，開發綠色、安全的新型抗菌藥物迫在眉睫。

圖1 白色念珠菌兩相態的轉化Fig.1 Two-phase transformation of Candida albicans

抗菌乳液作為一種新興的抗菌藥物，因為能有效保護活性成分[6]而被廣泛地研究。課題組前期選擇以表面活性劑吐溫-80作為橋梁將二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）和Ag+以物理方式或者弱化學鍵方式結合，制備抗菌乳液遞送體系，并系統研究了抗菌乳液穩定性及對金黃色葡萄球菌抗菌活性和機理，通過乳液形式達到DMY與Ag+協同抑菌的效果[7]。本文在前期制備了二氫楊梅素-銀離子（DMY-Ag+）納米乳液體系（以下簡稱乳液），在此基礎上進一步研究其對浮游態和生物被膜態白色念珠菌的抑制效果，進一步拓展新型天然抗菌乳液的應用領域，為以后的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

白色念珠球菌BNCC157492：廣東省微生物菌種保存中心；營養瓊脂、LB培養基：青島海博生物技術有限公司；沙氏瓊脂培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose agar，YPD）：北京索萊寶科技有限公司；二氫楊梅素（純度≥98%）：貴州苗藥生物有限公司；硝酸銀（分析純，純度≥99.8%）：廣州鐸洋生物科技有限公司。

FP-1100-C全自動生長曲線分析儀：芬蘭Bioscreen公司；ZWY-100H恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；UV-1800PC紫外-可見光分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；GHP-9080隔水式恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；HT7700透射電子顯微鏡：日立儀器設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳液的制備

向DMY醇溶液（乙醇體積分數20%）中加入吐溫-80水溶液，攪拌5 min，再逐漸滴加AgNO3（50 μg/L）水溶液，繼續攪拌10 min，得到乳液。具體制備方法參考文獻[7]。

1.2.2 菌懸液的制備

以白色念珠菌（BNCC157492）為模型菌，將已活化的菌株接種至含有2%NaCl的LB培養基中，37℃、150 r/min振蕩培養8 h～24 h，用紫外-可見分光光度計將菌懸液濃度調整至106CFU/mL。

1.2.3 乳液對浮游態白色念珠菌抑菌能力的測定

采用生長曲線法[8]和平板計數法測定乳液對浮游態和菌絲態白色念珠菌生長抑制效果。生長曲線法：分別向900 μL的AgNO3（50 μg/L）水溶液、DMY醇溶液（體積分數20%）、乳液和無菌水（空白組）中加入100μL濃度為106CFU/mL的菌懸液，在37℃、150 r/min振蕩培養5 min得到處理液，分別取0.3 mL處理液與0.1 mLYPD液體培養基混合于孔板中，用全自動生長曲線分析儀測定OD600nm記錄藥物對菌體的抑制情況，間歇振蕩（持續10 s，間隔10 s），記錄至45 h停止。

平板計數法：分別向900 μL的DMY醇溶液（體積分數20%）、乳液、AgNO3（50 μg/L）水溶液和無菌水（空白組）中加入100 μL濃度為106CFU/mL的菌懸液，在37℃、150 r/min振蕩培養5 min。處理后，取處理液100 μL涂布至沙氏營養瓊脂培養基，37℃培養72 h，分析藥物對酵母態白色念珠菌的抑制效果。取處理液100 μL接種至YPD液體培養基，37℃培養72 h，分析藥物對菌絲態態白色念珠菌的抑制效果。

1.2.4 白色念珠菌生物被膜形成的測定

將白色念珠菌接種到YPD液體培養基，37℃、150 r/min振蕩培養28 h，經過11 180×g離心3 min后收集白色念珠菌細胞，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌，將菌懸液濃度用目標培養液調為107CFU/mL。不同濃度的菌懸液可進行梯度稀釋并于培養基中培養形成生物被膜。取培養基中的細胞懸浮液200 μL加入到96孔板中，在 37 ℃下培養，分別在培養 1.5、3.0、12.0、24.0、48.0 h時進行結晶紫染色，取上清液，在570 nm測吸光度。

1.2.5 不同處理液對白色念珠菌生物被膜抑制能力的測定

將培養基中的細胞懸浮液加入到96孔板中，于37℃下培養約90 min，將乳液、DMY醇溶液（體積分數20%）、AgNO3（50 μg/L）水溶液和無菌水加入到新培養基中，在相同溫度下繼續培養，分別在1.5、12.0、24.0、48.0 h時測定570 nm處吸光度。

1.2.6 白色念珠菌微觀結構觀察

取1.2.3處理液在11 180×g離心10 min后丟棄上清液，用戊二醛（體積分數2.5%）將白色念珠菌細胞固定6 h，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌并在11 180×g離心3 min，將經過洗滌后的白色念珠菌細胞用不同梯度的乙醇溶液洗脫，洗脫后重懸并滴在銅網上，在37℃下干燥后用透射電子顯微鏡觀察。

1.3 數據處理

使用OriginPro 2019和Excel對所有數據進行統計，并根據數據進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 DMY-Ag＋納米乳液的理化性質

制備的乳液外觀為淺黃色透明液體，pH 6.6，其中DMY含量為2.5 mg/mL，銀離子濃度為50 μg/L，在4 500 r/min離心15 min后，樣液無分層或混濁，乳液粒徑200 nm左右[7]。

2.2 不同處理液對浮游態白色念珠菌的抗菌作用

不同處理液處理后白色念珠菌的生長曲線見圖2。

圖2 不同處理液處理后白色念珠菌的生長曲線Fig.2 The growth curve of Candida albicans treated with different treatment solution

由圖2可知，空白組與試驗組在生長周期相同的情況下，試驗組的OD值均低于空白組，試驗組對白色念珠菌的生長抑制效果要優于空白組，其中乳液對白色念珠菌的抑制效果最好。

不同處理液對固體培養基中酵母態白色念珠菌的抑制效果見圖3。

由圖3可知，相較于DMY組、Ag+組和空白組，經過72 h培養后乳液組中沒有白色念珠菌生長，可見乳液對白色念珠菌的抑制效果十分明顯；而DMY組和Ag+組有少量白色念珠菌菌落生長，雖然也表現出對白色念珠菌生長抑制作用，但總體抑制效果比乳液差；空白組經過培養后菌落出現了芽管的趨勢，經過72 h培養后還形成了大面積菌絲態的菌株。

不同處理液對液體培養基中菌絲態白色念珠菌的抑制效果見圖4。

圖3 不同處理液對固體培養基中酵母態白色念珠菌的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of different treatment solution Candida albicans in solid medium

圖4 不同處理液對液體培養基中菌絲態白色念珠菌的抑制效果Fig.4 Inhibitory effect of different treatment solution Candida albicans in liquid medium

由圖4可知，經過各處理液處理的白色念珠菌培養一段時間后，相較于乳液組和DMY組培養基中均未出現白色念珠菌菌落生長；空白組和Ag+組中出現菌絲態白色念珠菌菌群，尤其是空白組出現了大量的菌絲態白色念珠菌。由圖3和圖4可以發現，乳液對酵母態和菌絲態白色念珠菌的生長都具有很好的抑制效果；DMY對酵母態和菌絲態白色念珠菌的抑制效果有顯著差異，DMY對菌絲態白色念珠菌的抑制效果較酵母態白色念珠菌的抑制效果好；Ag+可以有效抑制白色念珠菌的酵母態轉化為菌絲態，但并不能抑制菌絲態的增殖，這可能與Ag+影響白色念珠菌的部分基因的表達有關[9-11]。

2.3 白色念珠菌生物被膜的形成

白色念珠菌生物被膜的形成時間曲線見圖5。

圖5 白色念珠菌生物被膜的形成時間曲線Fig.5 Time curve of Candida albicans biofilm formation

由圖5可知，可將白色念珠菌生物被膜的生長階段分為快速增長期、緩慢增長期和穩定期。在48 h內，生物被膜隨著時間的延長而不斷積累，最終保持不變。1.5 h生物被膜形成，在12 h內生長顯著上升，形成成熟生物被膜，24 h之后成熟生物被膜比較穩定。這個試驗結果與第一個白色念珠菌體外模型即DOUGLAS模型中的生物被膜發展基本一致[12]，說明可塑性較強的白色念珠菌的致病規律存在相似性。

2.4 不同處理液對白色念珠菌生物被膜形成的抑制

不同處理液對白色念珠菌生物被膜形成早期的抑制作用見圖6。

圖6 不同處理液對白色念珠菌生物被膜的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of different treatment solution on biofilm of Candida albicans

由圖6可知，在白色念珠菌黏附的1.5 h后，隨著孵育時間的增加，空白組的生物被膜量逐漸增加，而經過DMY、Ag+、乳液處理的白色念珠菌生物被膜量都較空白組低，其中經乳液處理后的白色念珠菌生物被膜量最低，且隨著孵育時間的增加乳液處理后生物被膜量逐漸降低，可見乳液對于白色念珠菌生物被膜的形成具有很好的抑制效果；當24 h形成成熟生物被膜后，乳液仍可較好地破壞已形成的成熟生物被膜。臨床上可用于治療念珠菌病的抗生素類藥物，部分已被證明對生物被膜的抑制效果不理想[13-15]，而乳液無論是在浮游態的白色念珠菌的抑制還是生物被膜的清除都具有較好效果。

2.5 不同處理液對白色念珠菌細胞形態結構變化的影響

不同處理液對白色念珠菌細胞形態結構變化的影響見圖7。

圖7 不同處理液對白色念珠菌細胞形態結構變化的影響Fig.7 Effects of different treatment solution on cell morphology of Candida albicans

由圖7可知，圖7A經過空白組處理后的白色念珠菌細胞完整[16]；圖7B經過Ag+處理后較少白色念珠菌細胞出現局部破裂；圖7C經過DMY處理后大部分白色念珠菌細胞出現破裂，有胞內物質流出；圖7D經過乳液處理的白色念珠菌變得粗糙，有褶皺，完整的形態出現部分斷裂，導致細胞很難聚合在一起。說明乳液通過改變細胞表面的特性，對細菌的細胞壁和細胞膜進行破壞從而達到抑制其生長增殖的效果，從而抑制浮游態和生物被膜細菌的活性。孫淑娟等[17]研究發現多酚化合物能影響白色念珠菌的表面結構，能使白色念珠菌的細胞膜和細胞壁發生一定的結構改變，使得胞內物質流失，造成細胞的死亡，其現象與本文結果一致。針對乳液的抗被膜活性、酵母態到菌絲態的轉變[18-19]、黏附基因[20-21]、菌絲形成基因[22]還需進一步研究乳液的作用機制。

3 結論

DMY-Ag+納米體系相較于單獨的DMY和Ag+處理白色念珠菌具有明顯的協同抗菌效果，并且能有效防止酵母態白色念珠菌轉化為菌絲態白色念珠菌，并且對菌絲態白色念珠菌表現出非常強抑菌效果。C.albzcans生長曲線測定結果顯示1.5 h后C.albican生物被膜形成，12 h內生長顯著上升，培養至24 h細進入生長的穩定期。乳液對生物被膜態的C.albicans有很好抑制作用，對成熟期的生物被膜具有清除作用。通過細胞形態結構變化發現乳液能改變細胞表面的特性，破壞菌的完整性進而破壞其正常的生命活性，影響其生長和增殖，從而抑制浮游態和生物被膜細菌的活性。關于乳液抑制C.albican生物被膜的分子機制還有待進一步的研究。