補腎活血湯治療腎虛血瘀證慢性心力衰竭的代謝組學研究

胡心荷，韓 晶，周秉誠，李 潔，安佰海

慢性心力衰竭是指持續存在的心臟循環功能障礙所致的心力衰竭，被認為是所有心血管疾病的最終事件[1]。流行病學調查顯示，我國慢性心力衰竭病人約有450萬例，且以每年約50萬例的速度增加[2]，嚴重威脅著國民的身體健康。現有的西藥在治療上具有諸多局限，如長期應用利尿劑會導致病人電解質紊亂；血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)可能會導致低血壓、高血鉀、干咳等，非藥物治療由于技術、費用、適應證等的限制也未能給大多數慢性心力衰竭病人帶來獲益[3]。而中醫強調整體觀念、辨證論治，且副作用較小，近年來在臨床上逐漸顯露優勢。

代謝組學是近年來興起的一門學科，通過對生物體小分子代謝物，尤其是特征性潛在標志物進行全面系統的定量分析，得到真實的生物學事件表型數據，以尋找與疾病生理病理變化的相對關系[4]。可見其對人整體的代謝狀況進行把握的觀念與中醫不謀而合，在提倡循證醫學和個體化治療的今天，代謝組學在中醫學領域前景廣泛[5]。針對慢性心力衰竭腎虛血瘀證病人研制的補腎活血湯，經過多年臨床研究驗證，取得了較滿意的效果。本研究采用代謝組學的方法探求補腎活血湯治療慢性心力衰竭腎虛血瘀證病人的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年6月—2019年6月就診于青島市海慈醫療集團心血管一科、心血管二科、干部保健科的慢性心力衰竭腎虛血瘀證病人共70例，隨機分為試驗組和對照組，各35例。另外選取2018年6月—2019年6月在青島市海慈醫療集團體檢中心的健康體檢者35名為健康組，年齡30～80歲，身體健康，無近期感染史，無吸毒史、嗜酒史。

1.2 診斷標準 慢性心力衰竭符合Framingham的心力衰竭診斷標準[6]，中醫腎虛血瘀證參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[7]，主癥：氣短、乏力、心悸、胸悶(痛)、腰膝酸痛；次癥：頭暈耳鳴、面浮肢腫、口干、小便短少、面色晦暗；舌脈：舌質暗紅、苔少或薄白、脈細澀。具備主癥和次癥各2項及以上，結合舌脈即可診斷。

1.3 納入標準 ①年齡18～80歲；②符合慢性心力衰竭的西醫診斷標準且美國紐約心臟病協會(NYHA)心功能分級為Ⅱ級或Ⅲ級，符合中醫腎虛血瘀證證候診斷標準；③知情同意并簽署知情同意書。

1.4 排除標準 ①急性及亞急性心力衰竭、重度心力衰竭，或NYHA心功能分級為Ⅳ級；②合并嚴重感染性疾病或其他惡性原發病；③妊娠期及哺乳期婦女；④有嚴重精神疾病。

1.5 治療方法

1.5.1 對照組 維持西藥常規治療，根據《中國心力衰竭診斷和治療指南》[6]的推薦，選用ACEI、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)、利尿劑、洋地黃類、β受體阻滯劑、醛固酮受體拮抗劑，試驗期間不得合并使用其他中藥湯劑和中成藥制劑，療程為2個月。

1.5.2 試驗組 在西藥常規治療的基礎上，加用中藥方劑補腎活血湯，組方：制附子15 g(先煎)，補骨脂15 g，熟地黃21 g，山茱萸21 g，黨參30 g，黃芪15 g，丹參21 g，赤芍15 g，葶藶子15 g(包煎)，大棗9 g。每日1劑，每次400 mL，分早、晚兩次飯后半小時溫服，持續2個月，試驗藥物由青島市海慈醫療集團中藥制劑室制備。

針對病人各自的基礎疾病，參照相關治療指南推薦，規范化進行控制血壓、調脂、降糖、抗凝等西藥治療，不予其他中藥制劑。并詳細記錄病人在觀察期間所使用藥物的名稱、劑量、用藥方法及用藥時間；觀察健康組試驗期間有無突發新病及特殊狀況。

1.6 血清樣本采集 所有參與試驗人員在采血前要求空腹8 h，1周內未飲咖啡、濃茶等，無其他有關飲食、生活方式、生理周期等的嚴格限制。于06：00左右在室溫下釆取4 mL靜脈血液樣本，自然凝固1 h后收集血清，于4 ℃下3 000 g離心10 min，收集上清液，置于-80 ℃冰箱冷凍待測。

1.7 核磁共振波譜試驗(NMR) 充分混勻血清樣品后，取200 μL與重水配制的磷酸鹽緩沖液400 μL充分混勻，在4 ℃下以12 000 r/min速率離心10 min，取560 μL加入核磁管，在Agilent-600高分辨核磁共振譜儀上進行NMR檢測，1H頻率為600.11 MHz，配備三共振高分辨探頭。采樣溫度為298 K，采樣次數為64次。每個樣品采樣前控溫至少5 min，每個樣品的90°脈沖寬度調整為10 μs左右，等待時間為2 s，每個樣品進行預飽和壓水峰的CPMG(carr-purcell-meiboom-gill)試驗，總的自旋-自旋回波時間為200 ms，在弛豫延遲期間進行預飽和壓水。

1.8 數據預處理與分析 對采集的所有一維1H-NMR譜圖的自由感應衰減信號(FID)加上增寬因子為1 Hz的指數窗函數后進行傅立葉變換以提高信噪比，手動進行相位和基線校正，所有樣品的核磁共振譜圖采用TSP進行定標。利用相關軟件將核磁共振譜圖進行積分，將積分后的數據歸一化后進行多變量數據統計分析，建立數學模型，得到用于評價模型質量的指標：R2X、R2Y和Q2。將潛在生物標志物導入Metaboanalyst數據庫，研究與心力衰竭相關的代謝通路。

2 結 果

2.1 1H-NMR譜圖 選擇各組中具有代表性的核磁共振譜圖，根據一維譜圖并結合公共數據庫(HMDB)對采集到的核磁共振信號進行歸屬，從3組獲得血清代表性CPMG 1H-NMR光譜(δ 0.7～5.4和δ 5.4～9.0)。為了清楚起見，與相應的δ 0.7～5.4區域相比，δ 5.4～9.0的區域(虛線框中)被放大了16倍。詳見圖1。

圖1 3組血清1H-NMR譜圖及主要代謝物譜峰歸屬(δ 0.7～5.4和δ 5.4～9.0)

2.2 主成分分析(PCA) 用SIMCA-P+軟件對歸一化后的數據進行模式識別多變量分析，PCA分析使用中心化換算，得到的數據分布越集中，表示組間差異越小；離散度越大，表示組間差異就越大。①總體PCA分析結果顯示，R2X=74.8%，Q2=0.728，詳見圖2；②健康組與試驗組的PCA分析結果顯示，R2X=73.3%，Q2=0.677，詳見圖3；③健康組與對照組的PCA分析結果顯示，R2X=87.2%，Q2=0.861，詳見圖4；④試驗組與對照組的PCA分析結果顯示，R2X=83.5%，Q2=0.804，詳見圖5。

圖2 總體樣本的PCA得分圖

圖3 健康組與試驗組的PCA得分圖

圖4 健康組與對照組的PCA得分圖

圖5 試驗組與對照組的PCA得分圖

2.3 偏最小二乘法-判別分析及驗證(PLS-DA) 使用SIMCA-P+軟件對歸一化后的數據進行PLS-DA分析，尋找數據之間的相關性；通過多次改變分類變量y的排列順序對模型有效性做進一步檢驗。①健康組和試驗組的PLS-DA分析及驗證結果顯示，R2X=31.9%，R2Y=0.732，Q2=0.541，截距：R2=(0.000，0.742)，Q2=(-0.201，0.000)，詳見圖6；②健康組與對照組的PLS-DA分析及驗證結果顯示，R2X=31.7%，R2Y=0.705，Q2=0.344，截距：R2=(0.000，0.763)，Q2=(-0.142，0.000)，詳見圖7；③試驗組與對照組的PLS-DA分析及驗證結果顯示，R2X=28.1%，R2Y=0.705，Q2=0.431，截距：R2=(0.000，0.719)，Q2=(-0.208，0.000)，詳見圖8。

圖6 健康組與試驗組的PLS-DA得分圖、排列試驗圖(A為PLS-DA得分圖；B為排列試驗圖)

圖7 健康組與對照組的PLS-DA得分圖、排列試驗圖(A為PLS-DA得分圖；B為排列試驗圖)

圖8 試驗組與對照組的PLS-DA得分圖、排列試驗圖(A為PLS-DA得分圖；B為排列試驗圖)

2.4 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA) 使用SIMCA-P+軟件對正交信號矯正處理過的PLS-DA模型進行OPLS-DA分析，尋找對分組貢獻性較大的譜峰信號和相應代謝物。①健康組與試驗組的OPLS-DA分析結果顯示，R2X=31.9%，Q2=0.455，詳見圖9；②健康組與對照組的OPLS-DA分析結果顯示，R2X=31.8%，Q2=0.313，詳見圖10；③試驗組與對照組的OPLS-DA分析結果顯示，R2X=21.8%，Q2=0.431，詳見圖11。

圖9 健康組與試驗組的OPLS-DA得分圖及相應系數載荷圖(A為OPLS-DA得分圖；B、C為相應系數載荷圖)

圖10 健康組與對照組的OPLS-DA得分圖及相應系數載荷圖(A為OPLS-DA得分圖；B、C為相應系數載荷圖)

圖11 試驗組與對照組的OPLS-DA得分圖及相應系數載荷圖(A為OPLS-DA得分圖；B、C為相應系數載荷圖)

2.5 差異代謝物的篩選及鑒定 將每一個變量的loading值與其標準偏差的平方根值相乘后進行數據的回溯轉換，然后與相應的相關系數臨界值表進行比對，得到引起組間差異的代謝物。相關系數的正負號分別表示濃度的正負相關，在P=0.05且df(自由度)=29時判別顯著性，將∣r∣>0.355的相關系數作為有統計學意義的臨界值，小于此系數則忽略不計。詳見表1。

表1 3組間對分組貢獻較大的差異代謝物濃度變化

2.6 差異代謝物的相關通路分析 將獲得的19種潛在生物標志物導入Metaboanalyst數據庫，研究與心力衰竭相關的代謝通路，如圖12所示，代謝通路影響值(pathway impact)由拓撲分析計算所得，代謝通路影響值和-logP分別代表代謝通路的重要性和代謝通路富集分析的顯著性水平[8]。本研究中選擇代謝通路影響值的臨界設置為0.1，高于此值認為與潛在的靶標路徑關系密切。共篩選出4條與補腎活血湯治療慢性心力衰竭腎虛血瘀證相關的代謝通路：苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝、精氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝。

圖12 差異代謝物參與的代謝途徑富集分析

3 討 論

代謝組學是系統生物學的重要組成部分，能夠靈敏地揭示生物體內源性物質受刺激后引起的代謝物的變化，近年來廣泛應用于中醫證候機制研究。中藥方劑作用在機體不同層次的不同靶標上會引起一系列內源性代謝物的組成和濃度發生變化，通過測定這些相互關聯的變化有利于從全局上把握中藥方劑的作用機制。

李潔教授在長期的診療實踐過程中發現，慢性心力衰竭病人的多個證型中，以腎虛血瘀證最為常見。認為其基本病機為腎虛血瘀、瘀血阻脈、氣血不暢、水道不通，治療上以補腎活血、化瘀利水為法。基于這一理論創立補腎活血湯，臨床應用多年，取得了滿意的療效。

從1H-NMR譜圖中可以看出，3組代謝物多為氨基酸、糖類、脂類等小分子物質。總的PCA得分圖顯示，3組樣本之間的聚集現象明顯，說明有統計學意義，健康組樣本點分布相對集中，表明個體之間差異較小；試驗組和對照組樣本點分布相對分散，表明兩組自身個體之間差異較大。之后分別在3組之間進行兩兩PCA分析比較，發現組間都有明顯的聚集現象，提示有統計學意義，且組間的樣本點分布較為分散，說明代謝物差異顯著，其中健康組和試驗組重合的樣本點相對較多，說明兩組相似度更大。

通過PLS-DA得分圖和排列試驗驗證結果，與模型的可解釋指標R2X和可預測指標Q2共同提示，所建立的數學模型穩定可靠，說明組間代謝物差異較為顯著。后對進行過PLS-DA分析的數據進一步進行OPLS-DA，獲得19個對分組貢獻性較大的譜峰信號和相應代謝物，主要包括氨基酸、脂類和糖類，與健康組相比，對照組中有13個差異代謝物發生顯著變化，經補腎活血湯給藥后，其中9個具有回調作用，主要包括苯丙氨酸、酪氨酸、檸檬酸等，依據這9個回調的生物標志物找到苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝、精氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝等4條相關代謝通路。

苯丙氨酸是人體必需的氨基酸，由膳食中的蛋白質提供，通過摻入細胞蛋白、轉化為苯丙酮酸、轉化為酪氨酸進入人體，酪氨酸可轉化為左旋多巴，然后進一步轉化為多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素[9]，去甲腎上腺素和腎上腺素均可收縮血管，增強心肌收縮力。在該條通路中描述的是苯丙氨酸通過氨基酸氧化酶或酪氨酸氨基轉移酶轉化為苯丙酮酸、苯丙氨酸通過苯丙氨酸羥化酶轉化為酪氨酸以及苯丙氨酸和/或酪氨酸并入多肽，這個反應既作為苯丙氨酸和酪氨酸分解代謝的第一步，又作為酪氨酸的來源[10]。考慮可能由于慢性心力衰竭病人酶缺陷或氨基酸吸收轉運系統缺陷，氨基酸的代謝通路受阻，導致對照組苯丙氨酸、酪氨酸的含量較健康組明顯減少，給藥后扭轉了趨勢，說明補腎活血湯發揮了正向的干預調節作用。

在成年哺乳動物中，精氨酸主要通過腸-腎軸進行合成[11]，在包括尿素循環、多聚氨基酸和肌酸合成、免疫功能調節和一氧化氮合成在內的正常和疾病狀態下的各種代謝過程中起關鍵作用[12]。精氨酸作為免疫調節劑，對機體炎癥的抑制至關重要，研究表明，精氨酸不僅可以通過一氧化氮代謝途徑增強機體免疫能力，而且能調節蛋白激酶信號通路抑制促炎基因表達[13-14]。該條通路顯示補腎活血湯可能通過炎癥抑制、免疫功能等方面參與調節。

淀粉和蔗糖代謝途徑中，唾液中的淀粉酶在淀粉消化中起重要作用，淀粉消化的產物包括但不限于麥芽三糖、麥芽糖、極限糊精和葡萄糖，小腸微絨毛的腸上皮細胞進一步將極限糊精和二糖分解為葡萄糖、半乳糖和果糖[15]。葡萄糖是維持細胞活動的最基本的能量來源，通過三羧酸循環的方式參與供能，三羧酸循環是糖脂代謝的最終通路，是機體獲得能量的主要方式，三羧酸循環受阻意味著葡萄糖、脂肪的代謝紊亂[16]。檸檬酸是三羧酸循環中的重要中間產物，由乙酰輔酶A和草酰乙酸縮合而成，除了參與三羧酸循環供能外，檸檬酸還涉及體內的有氧代謝，其形成減少表明有氧代謝的減弱[17]。臨床上心力衰竭常合并低氧血癥，低氧血癥的發生可進一步加重心力衰竭[18]。相比于對照組，給藥后試驗組葡萄糖和檸檬酸含量明顯增加，說明補腎活血湯可以調節代謝途徑，降低三羧酸循環、有氧代謝受到抑制的程度。

綜上所述，本研究對慢性心力衰竭腎虛血瘀證病人的代謝標志物進行了初步的探索，獲得了一些潛在的標志物，并探索了4條主要的代謝通路，為進一步探索中醫藥防治慢性心力衰竭腎虛血瘀證提供了客觀的生物學支持。試驗的設計與實施較為科學合理，驗證了補腎活血湯能有效改善慢性心力衰竭腎虛血瘀證病人部分紊亂的代謝物水平，主要涉及苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝、精氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝等。