不同基源川貝母藥材中無機元素的ICP-MS分析

李小紅, 梁勝婷, 茍 琰, 郭 力, 郭曉強,耿 昭, 周 闖

(1. 成都中醫藥大學 藥學院, 四川 成都 611137; 2. 成都大學 食品與生物工程學院, 四川 成都 610106; 3. 四川食品藥品檢驗檢測院, 四川 成都 611731； 4. 成都大學 農業農村部雜糧加工重點實驗室, 四川 成都 610106;)

著名川產道地藥材川貝母為百合科(Liliaceae)貝母屬(Fritillaria)的干燥鱗莖,歷來被認為是潤肺止咳的要藥[1].現代研究表明,川貝母具有廣泛的藥理作用,包括鎮咳、抗炎、祛痰、平喘、鎮靜、鎮痛等,被認為是貝母類藥材中最具藥用價值的復合群.其藥效成分除生物堿、皂苷、萜類、甾體、脂肪酸等有機化合物外,還富含多種無機元素[2-7].無機元素對中藥材質量具有重要的影響,一方面其易與生物體內含氮、氧、硫的配體形成配位鍵對藥效發揮著協同作用,但另一方面重金屬及有害元素又能與人體中的蛋白質、氨基酸等物質發生反應致使其生化功能改變或者喪失,是中藥材最主要的有害污染物質,也是中藥材進出口的重要檢測指標之一[8].同時,川貝母的基源較為復雜,《中國藥典》(2015年版一部)收載的川貝母包括6個藥用植物來源,即卷葉貝母(F.cirrhosaD.Don)、暗紫貝母(F.unibracteataHsiao et K.C.Hsia)、甘肅貝母(F.przewalskiiMaxim.)、梭砂貝母(F.delavayiFranch.)、太白貝母(F.taipaiensisP.Y.Li)和瓦布貝母 [F.unibracteataHsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C. Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.chen][9],它們的地理分布相互重疊,特別是前3種在橫斷山區北部和中部地區可同時出現,且生長環境完全一致,通常難以鑒別[10].本研究采用ICP-MS對共計80批川貝母藥材的無機元素含量進行測定,建立了川貝母藥材的無機元素指紋圖譜,并用SPSS 25.0對數據進行主成分分析(PCA)及相關性分析,并通過對不同基源川貝母藥材中含量差異顯著的元素進行逐步判別分析,以期對川貝母藥材的質量控制、安全性評價和品種鑒別提供更多的基礎數據和科學依據.

1 分析設備與材料

設備：X2電感耦合等離子體-質譜儀(美國Thermo Fisher公司)；MARS6微波消解萃取儀(美國 CEM 公司)；CPA225D電子天平(德國Sartorius公司)；Millipore Q純水系統(美國Merck公司)；各種規格的移液器(德國Eppendorf公司).

材料：各元素標準溶液均為國家標準樣品，購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心,質量濃度均為1 000 μg/mL，內標溶液的單元素標準溶液(質量濃度1 000 μg/mL),購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心，標號如表1；MOS級HNO3(CNW,德國).

共計80批的川貝母樣品.其中,暗紫貝母13批、甘肅貝母7批、卷葉貝母14批、梭沙貝母15批、瓦布貝母21批、太白貝母10批,樣品采自各地藥材種植基地、專業中藥材市場、醫院及藥房等,收集時間為2017年12月至2018年5月.所有樣品均經四川省食品藥品檢驗檢測院黎躍成主任藥師鑒定,符合《中國藥典》2015年版相關規定.

2 方法與結果

2.1 標準品溶液的制備分別精確量取上述各單元素標準溶液1 mL,用質量分數5% HNO3定容至100 mL,搖勻,作為對照品貯備溶液(各元素質量濃度為10 μg/mL).精確量取不同體積的上述對照品貯備液稀釋后,配成不同質量濃度的多元素混合對照品溶液.根據各元素在樣品中含量的具體情況,選取不同的線性范圍.

2.2 供試品溶液的制備取供試品約0.5 g,精確稱定,置微波消解罐中,加HNO37 mL,放置60 min,密閉,放入微波消解儀中,按設定的消解程序處理：從室溫5 min升至120 ℃,保持10 min,再7 min升至160 ℃,保持15 min,再5 min 升至180 ℃,保持25 min.消解完畢后,冷卻取出,揮去濃煙,用去離子水將消解液轉入50 mL量瓶中,用少量去離子水洗滌消解罐3次,洗液并入量瓶中,用去離子水稀釋至刻度,搖勻,即得,供含量較低的元素測定.對于含量過高的Na、Al、K、Ca和Fe元素,取上述供試品溶液再稀釋50倍即得.

2.3 內標溶液的制備取7Li、45Sc、73Ge、115In、209Bi作為內標溶液,用質量分數5% HNO3稀釋,制成每1 mL各含10 ng的混合溶液.

2.4 測定條件ICP-MS測定條件：射頻功率為1 400 W,采樣深度114 step,載氣流速0.91 L/min,輔助氣流量0.84 L/min,冷卻氣流速13 L/min,蠕動泵采集時轉速30 r/min,積分時間40 s.測定9Be和11B時,以7Li作為內標；測定23Na、27Al、39K、44Ca、52Cr、55Mn和56Fe時,以45Sc作為內標；測定60Ni、65Cu、75As、82Se和95Mo時,以72Ge作為內標；測定111Cd、118Sn、121Sb、137Ba、159Tb和163Dy時,以115In作為內標；測定208Pb時,以209Bi作為內標.

2.5 方法學考察

2.5.1線性關系考察 按2.1配備系列混合元素對照品溶液,按上述實驗條件進行測定,以各元素質量濃度(ng/mL)為橫坐標(X),相應儀器響應值(ICPS)為縱坐標(Y),繪制標準曲線,各元素標準品的回歸方程、相關系數和線性范圍結果見表2.

2.5.2檢出限 線性實驗前取空白溶液按上述條件,連續測定11次,以測定元素的信號響應值的標準偏差(δ)的3倍所對應的質量濃度為檢測限,結果見表2,各元素的檢出限范圍為0.003～2.221 ng/mL；以3.3倍檢出限作為定量限,各元素的檢出限范圍為0.010～7.410 ng/mL.

2.5.3精密度考察 取質量濃度為50 ng/mL的上述各元素混合對照品溶液照上述方法進樣測定6次,記錄各元素響應值,并計算相對標準偏差(RSD),結果見表2.

2.5.6穩定性考察 取質量濃度為50 ng/mL的上述各元素混合對照品溶液,置0～5 ℃保存,照上述方法分別在第0、24 h進行測定,記錄各元素響應值,考察對照品溶液穩定性,結果見表2.各元素兩次測定結果RSD為0.21%～1.94%.表明對照品溶液在24 h內穩定,該測定方法穩定性好.

2.5.7重復性考察 取樣品粉末約0.5 g,精確稱定,按2.2的方法,平行制備 6 份,按上述方法進行測定,計算各元素含量和RSD,結果見表2.大多數元素的RSD均小于5%(Se、Pb因濃度過低,RSD大于5%),表明方法重復性較好.

2.5.8準確度考察(加樣回收) 取樣品粉末約0.25 g,精確稱定,分別加入適量已測定的各元素標準溶液.按2.2的方法制備供試品溶液,分別平行制備6份,測定,計算各元素回收率和RSD,結果見表2.

表 2 21種元素的線性回歸方程、檢出限、精密度、重復性、穩定性和回收率

2.6 無機元素的測定不同基源的川貝母樣品,精確稱定,按2.2的方法制備供試品溶液進行測定,計算80批樣品中各元素的含量,結果見表3.

結果表明川貝母藥材中含有豐富的無機元素,幾種不同藥用植物來源的無機元素種類組成差異性不大,但含量差異較大.

所測常量元素中,平均質量分數最高的是K(4 027.363 μg/g),其次為Ca(586.725 μg/g)、Fe(191.273 μg/g)、Al(124.729 μg/g)、Na(104.235 μg/g)元素的總含量占本研究所測21種元素含量的99.60%(圖 1).

微量元素中平均質量分數由高到低為Mn(9.354 μg/g)、Ba(3.321 μg/g)、Cu(2.601 μg/g)、B(2.089 μg/g)、Ni(1.061 μg/g)、Cr(0.924 μg/g)、Mo(0.269 μg/g)、Pb(0.133 μg/g)、Cd(0.094 μg/g)、As(0.091 μg/g)、Se(0.044 μg/g)、Sn(0.004 μg/g)和Dy(0.002 μg/g),其中Sn、Sb、Be僅在個別樣品中有微量檢出,所有川貝母藥材樣品均未檢出Tb元素.重金屬及有害元素中,僅有一批太白貝母樣品中Cu元素含量超出《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》限量指標(w(Cu)≤20 μg/g),其余所有樣品均符合要求.

表 3 川貝母樣品中21種無機元素含量測定結果

注：“-”表示未檢出； “ ”表示超出限度；樣品用去離子水稀釋 50 倍以測定 Na、Al、K、Ca 和 Fe

圖 1 川貝母中各元素的占比分析

2.7 無機元素指紋譜的建立將所有樣品按各自所屬的基源,取其無機元素含量的均值,根據定量測定的結果,篩選出16種元素建立指紋圖譜,為了繪制過程方便,將一些含量懸殊的元素同時縮小或擴大一定的倍數至同一數量級(K縮小1 000倍,Ca縮小100倍,Na、Al、Fe縮小10倍,Cr、Ni、Mo、Cd、Pb放大10倍,As、Se放大100倍),繪制結果見圖2.該指紋圖譜表明,不同基源川貝母藥材中的Fe、Al、As、Mo、Ba具有相似峰形,且Fe>Al>As>Mo≈Ba,可作為川貝母與其它藥材的無機指紋圖譜的區別特征.而各基源的川貝母藥材中的無機元素差異,可根據相應的特征曲線來區分.

圖 2 6種不同基源川貝母無機元素指紋譜

2.8 無機元素間的主成分分析(PCA)為了闡明川貝母藥材中無機元素的關聯關系,應用SPSS 25.0統計軟件對川貝母中的16種無機元素進行主成分分析(PCA).

主成分的特征值及貢獻率是選擇主成分的依據,表4描述了主成分分析初始解對原有變量的總體描述情況.從中可以看出,前6個主成分的累積貢獻率達71.78%,它們代表了川貝母藥材中大多數無機元素的信息.

表 4 特征值及貢獻率

KMO統計量與Bartelett球形檢驗結果顯示,KMO統計量=0.674,球形檢驗卡方統計量=762.040,P<0.01,適于因子分析.

由因子載荷矩陣表(表5)可以看出,第1個主成分和K、Mo、B呈正相關,第2個主成分和Al、Fe、Pb呈正相關,第3個主成分和Se、Mn呈正相關,第4個主成分和Cd呈正相關,第5個主成分和Cr呈正相關,第6個主成分和Na呈正相關.因為總方差的71.78%的貢獻來自于前6個主成分,因此可以認為K、Mo、B、Al、Fe、Pb、Se、Mn、Cd、Cr、Na是川貝母藥材的特征無機元素.

2.9 無機元素量間的相關性分析應用SPSS 25.0統計軟件對原始數據進行相關性分析,各無機元素含量間相關性結果見表6.結果顯示,有22對元素極顯著正相關(P<0.01),10對元素為正相關(P<0.05)；有5對元素極顯著負相關(P<0.01)：B-Ba、Ca-Ba、K-Ba、Mo-Ba、Ni-Mo；4對元素為負相關(P<0.05)：Al-K、K-Ni、Ca-Ni、Mn-Fe.上述顯正相關的元素對可能有一定相互協調、促進吸收的關系,而顯負相關的元素對則可能有一定相互拮抗、阻礙吸收的關系,其結果可為進一步開展川貝母藥材在生長發育過程中的生理生化機制及施肥策略提供參考.

表 5 旋轉變換后的因子矩陣

表 6 川貝母藥材無機元素含量間相關性分析

*:P<0.05;**:P<0.01

2.10 依據無機元素含量對其品種的判別分析為進一步分析川貝母藥材中元素特征和各品種之間的相關性,本實驗對16種含量差異顯著的元素進行了逐步判別分析,篩選出對川貝母藥材品種判別有效的變量,建立數學判別模型.分析結果表明,Na、K、Cr、Se、Cd 5種元素被篩選出來并用于建立判別函數模型,線性判別方程系數見表7.

表 7 Fisher線性判別函數

對建立的模型進行回代檢驗和交叉檢驗,典型判別函數散點圖見圖3,判別結果見表8.結果表明,80批樣品中回代檢驗和交叉檢驗的整體判別正確率分別為76.3%和71.3%,這說明多種元素含量對川貝母藥材品種的判別有較好的判別效果.其中,對梭砂貝母和太白貝母的正確判別率高達90%以上；其次為甘肅貝母和瓦布貝母,均為71.4%；而卷葉貝母和暗紫貝母的組質心距離很近,導致判別率偏低.

圖 3 典型判別函數散點圖

表 8 判別分析的分類結果

3 討論

中藥中無機元素對其藥材本身而言,可影響其植物體內的營養吸收及生理代謝過程,進而影響次級代謝產物的形成和累積；對人體而言,可與體內的多種配體形成配位鍵,進而參與體內的代謝過程或協調體內物質平衡[8].因此,無機元素是評價藥材品質的重要指標之一.電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)是無機元素的測定方法之一,因其具有線性范圍寬、靈敏度高、分析速度快、抗干擾能力強等優點,現已被廣泛應用在食品和藥品等領域的多元素同時分析測定[11-15].

本研究采用ICP-MS對80批川貝母藥材中21種無機元素進行了測定及分析.同時,對川貝母樣品微波消解條件進行了篩選,最終選擇7 mL硝酸按文中的消解程序進行消解,該消解程序是經實驗室長期摸索得到的,經過多個中藥品種、長時間的實驗證明,能夠滿足大多數中藥品種的消解.試驗結果表明,川貝母藥材中K、Ca、Fe、Al、Na的平均質量分數均超過100 μg/g；Mn、Ba、Cu、B、Ni、Cr、Mo、Pb、Cd、As、Se、Dy的含量相對較低；Sn、Be、Sn的檢出率低；Tb未檢出；參照《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》重金屬及有害元素的限量標準,僅有一批川貝母藥材(太白貝母)中的Cu含量超標.根據不同基源川貝母無機元素指紋譜圖可以看出,雖然不同基源的川貝母藥材無機元素含量有一定差異,但其元素分布規律基本呈相似的趨勢.主成分分析結果表明,K、Al、Mo、B、Al、Fe、Pb、Se、Mn、Cd、Cr、Na是川貝母藥材的特征無機元素.相關性分析結果表明,有27對元素極顯著相關,正或負相關性元素對表明這些無機元素在累積吸收過程中可能具有一定的協同或拮抗作用.采用逐步判別分析法表明,本研究所建判別函數模型對梭砂貝母和太白貝母的正確判別率高達90%以上,為川貝母的基源鑒別提供了新的參考方法.

綜上所述,本研究建立了ICP-MS法同時分析川貝母藥材中無機元素含量的方法,對不同品種基源的川貝母藥材進行比較分析,獲得了其無機元素含量測定的準確數據,同時建立了不同基源川貝母藥材的無機元素指紋譜,并用SPSS 25.0進行了相關性分析、主成分分析,從而為市售川貝母藥材或飲片的質量控制及安全性評價提供科學的參考依據.

致謝成都大學校基金項目(2017XJZ03) 、農業農村部雜糧加工重點實驗室項目(2018CC25)對本文給予了資助,謹致謝意.