MAGEA6在胃癌中的表達及其意義

湯月良，鄧冠群

廣州市增城區人民醫院普通外科，廣州 511300

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤，目前已成為全球癌癥相關死亡的第二大原因。統計顯示，我國每年新增胃癌患者約60萬例[1]。近年來，隨著內鏡技術、外科手術及放化療水平的提高，胃癌診治效果已有一定改善，但總體生存率仍較低。由于大部分胃癌患者早期臨床癥狀不典型，多數患者首次確診時已是晚期，而早期確診的胃癌經治療，5年生存率可達90%甚至更高[2]。因此，尋找特異性強、靈敏度高的生物標志物和有效的治療靶點，對提高胃癌的早期診斷率和生存率具有重要意義[3-4]。黑色素瘤抗原基因(melanoma antigen gene，MAGE)屬于腫瘤相關抗原家族，是van der Bruggen等[5]在黑色素瘤患者的腫瘤相關抗原中發現的。MAGE家族A(MAGEA)由12個基因MAGEA1-12組成，其中MAGEA6近年來被發現與多種消化道腫瘤關系密切。據報道，MAGEA6在食管癌和肝癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，且高表達MAGEA6的食管癌和肝癌患者生存率較低[6-7]。有研究發現，MAGEA6可通過抑制腫瘤細胞自噬而促進胰腺癌的發生和發展[8]，但其在胃癌組織中的表達情況、臨床意義及生物學作用鮮見報道。本研究分析了胃癌組織中MAGEA6的表達情況及其與胃癌患者預后和臨床病理特征的關系，并探索了其在胃癌細胞中的生物學作用。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器 BGC-823胃癌細胞系購自中科院上海細胞庫；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、RPMI 1640細胞培養基、青鏈霉素雙抗、胰酶、脂質體LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8試劑盒、Annexin V-PE凋亡試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發光試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；mRFP-GFP-LC3-Ⅱ腺病毒購自上海漢恒生物科技有限公司；MAGEA6、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ)、p62蛋白(sequestosome 1，p62)、自噬相關基因5(autophagy related gene 5，Atg-5)蛋白、酵母ATG6同源物(autophagy related gene 6，Beclin 1)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorated protein kinase B，p-Akt)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphorated mammalian target of rapamycin，p-mTOR)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體購自英國Abcam公司；免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。微光分光光度計購自美國Merinton公司；Mini-Proten Tetra System電泳系統和ChemiDoc XRS+System凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；ACCURI C6流式細胞儀購自美國BD公司；Tecan Infinite Pro全波長多功能酶標儀購自中國Tecan公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；激光共聚焦顯微鏡購自美國Zeiss公司；透射電鏡購自荷蘭Philips公司。

1.2 胃癌組織芯片 胃癌組織芯片樣本90例由本院樣本庫提供，為2009年12月-2010年6月經手術切除的胃癌組織和癌旁組織，其中男68例，女22例。納入標準：(1)病理診斷為胃部腺癌、印戒細胞癌和黏液癌；(2)既往未進行放療和化療；(3)行根治性胃癌切除術。排除標準：(1)胃惡性間質瘤；(2)神經內分泌癌；(3)因手術并發癥死亡；(4)病歷資料不完整。

1.2.1 免疫組化檢測胃癌組織芯片中MAGEA6的表達情況 將芯片組織進行脫蠟、水化，H2O2阻斷內源性過氧化物酶，使用EDTA/枸櫞酸鈉溶液進行抗原修復，加入MAGEA6(1∶200)一抗4 ℃下孵育過夜；PBS清洗3次，加入生物素標記的二抗(1∶200)室溫孵育30 min；PBS清洗3次，加入鏈霉菌抗生物素過氧化物酶溶液室溫孵育20 min；PBS清洗4次，行DAB染色，然后行蘇木精染色；清洗后乙醇脫水、二甲苯透明，使用中性樹膠固定封片，顯微鏡下觀察，對每個視野進行染色強度計分和陽性細胞百分比評分。染色強度計分：無明顯著色、輕微著色、中度著色和重度著色分別計為0、1、2、3分；陽性細胞百分比評分：陽性細胞百分比≤5%、5%～25%、25%～50%、50%～75%和>75%分別計為0、1、2、3、4分。最終評分=陽性細胞百分比評分+染色強度計分。最終評分≥4分為高表達，<4分為低表達。

1.2.2 MAGEA6表達與胃癌臨床病理特征的關系

收集胃癌患者性別、年齡、腫瘤大小(<5 cm；≥5 cm)、腫瘤部位(胃竇、胃體、賁門)、淋巴轉移(陰性/陽性)、病理分型(腺癌、印戒細胞癌、黏液癌)、TNM分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期)等一般資料。依據MAGEA6的表達情況，將胃癌患者分為MAGEA6高表達組與MAGEA6低表達組，分析MAGEA6表達與胃癌臨床病理特征的關系。

1.2.3 生存分析 采用Kaplan-Meier Plotter 40(KM Plotter)在線工具(http://kmplot.com/)，選擇基因芯片數據集GSE62254、GSE15459、GSE29272分析胃癌患者的MAGEA6表達情況及其預后，生存曲線圖、病例數、風險比(hazard ratio，HR)及log-rankP值從數據庫中獲取。90例胃癌患者的生存情況采用GraphPad Prism 8.0軟件進行分析。

1.3 細胞分組及處理 BGC-823細胞于RPMI 1640(含10% FBS和1%青鏈霉素雙抗)完全培養基中培養，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫細胞培養箱中；當細胞融合度為70%～80%時，用胰蛋白酶消化，按照1∶2的比例傳代。取對數生長期細胞接種于6孔板中(2×105個/孔)，當細胞融合度達到50%時，設置si-MAGEA6組與si-Ctrl組，參照LipofectamineTM2000轉染說明書操作，si-MAGEA6組加入10 μlsi-MAGEA6轉染，si-Ctrl組加入150 μl siRNA空載體對照轉染，轉染24 h后更換培養基，并進行后續實驗。

1.3.1 CCK-8法檢測細胞活力 將轉染后的BGC-823細胞接種于96孔板中(密度為5×103個/ml)，分別在轉染后24、48和72 h檢測細胞活性。每孔加入10 μl CCK-8試劑，37 ℃孵育4 h，使用酶標儀檢測各孔450 nm處的吸光度(OD)值。

1.3.2 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 離心并收集細胞，取2×105個細胞，PBS清洗3次，加入Annexin V-FITC結合液重懸細胞，依次加入Annexin V/FITC和PI，室溫避光孵育20 min，在避光條件下上機檢測細胞凋亡情況。

1.3.3 Western blotting檢測MAGEA6、凋亡相關蛋白、自噬相關蛋白及Akt/mTOR信號通路相關蛋白的表達 收集細胞，使用RIPA裂解液提取總蛋白。使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，并轉至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉封閉2 h；加入MAGEA6、Bcl-2、Bax、LC3-Ⅱ、p62、Atg-5、Beclin 1、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR和GAPDH單克隆一抗(1∶1000)并于4 ℃搖床中孵育過夜；PBST洗膜3次，加入兔二抗(1∶1000)避光孵育1 h；PBST洗膜3次，使用Odyssey IR凝膠成像儀進行掃描并拍照，ImageJ軟件進行灰度值分析，計算目的蛋白與相應內參條帶灰度值的比值。

1.3.4 掃描電鏡觀察自噬小體形成情況 收集細胞，PBS清洗3次，使用戊二醛(3%)固定細胞，丙酮梯度脫水；將細胞包埋在環氧樹脂中，切片，使用枸櫞酸鉛和醋酸鈾染色，透射電鏡觀察細胞中自噬小體形成情況。

1.4 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞自噬流變化 將對數生長期BGC-823細胞接種于6孔板中(2×105個/孔)，用si-MAGEA6轉染24 h，然后用感染復數為300的mRFP-GFP-LC3-Ⅱ腺病毒感染24 h，收集細胞爬片，4%多聚甲醛溶液室溫固定，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察BGC-823細胞內自噬流的變化。

1.5 統計學處理 使用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。計量數據以±s表示，符合正態分布且方差齊時，兩組間比較采用Student'st檢驗；計數資料以率(%)表示，兩組間比較采用χ2檢驗。使用Kaplan-Meier在線工具進行生存分析，使用log-rank法對MAGEA6高表達組和低表達組患者的生存率進行比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MAGEA6在胃癌組織中的表達情況 免疫組化檢測結果顯示，MAGEA6主要表達于細胞質中(圖1A)；胃癌組織MAGEA6免疫組化評分明顯高于癌旁組織[(3.77±1.50)分vs. (2.58±1.11)分，P<0.05，圖1B)；胃癌組織MAGEA6高表達率明顯高于癌旁組織[57.8%(52/90)vs. 20.0%(18/90)，χ2=27.02，P<0.001，圖1C]。

圖1 胃癌組織與癌旁組織中MAGEA6的表達情況Fig.1 Expression of MAGEA6 in gastric cancer and paracancerous tissues

2.2 MAGEA6表達與胃癌臨床病理特征的關系MAGEA6表達水平與胃癌患者的性別、腫瘤大小、腫瘤部位、病理分型及有無淋巴轉移無關(P>0.05)，而與年齡、TNM分期有關(P<0.05，表1)。

表1 MAGEA6表達與胃癌患者臨床病理特征的關系[例(%)]Tab.1 Relationship between the expression of MAGEA6 and the clinicopathological characteristics of gastric cancer patients[n(%)]

2.3 MAGEA6表達與胃癌預后的關系 Kaplan-M e i e r P l o t t e r 生存分析結果顯示，基因芯片GSE62254、GSE29272數據集中MAGEA6高表達的胃癌患者中位生存期與MAGEA6低表達患者比較差異無統計學意義(GSE62254：20.13個月vs. 25.87個月，P=0.230；GSE29272：22.00個月vs. 25.90個月，P=0.066)；GSE15459數據集中MAGEA6高表達的胃癌患者中位生存期短于MAGEA6低表達的患者(26.50個月vs. 30.40個月，P=0.021) (圖2A-C)。

對本組90例胃癌患者進行生存分析，結果顯示，MAGEA6高表達組患者的中位生存期短于MAGEA6低表達組，但差異無統計學意義(25.50個月vs. 64.50個月，P=0.080，圖2D)。

圖2 MAGEA6表達與胃癌患者預后的關系Fig.2 Relationship between MAGEA6 and prognosis of patients with gastric cancer

2.4 敲減MAGEA6表達對胃癌細胞增殖和凋亡的影響 CCK-8法檢測結果顯示，與si-Ctrl組比較(48 h：1.33±0.10；72 h：1.79±0.14)，si-MAGEA6組胃癌細胞在轉染48 h(0.80±0.07)和72 h(1.15±0.09)的OD450明顯降低(P<0.05，圖3A)。

流式細胞術檢測結果顯示，與si-Ctrl組比較，si-MAGEA6組細胞凋亡率明顯增高(14.97%±0.86%vs. 4.63%±0.55%，P<0.05，圖3B)。

圖3 敲減MAGEA6表達對胃癌細胞增殖和凋亡的影響Fig.3 Effect of knockdown of MAGEA6 expression on proliferation and apoptosis of gastric cancer cells

Western blotting檢測結果顯示，si-MAGEA6組MAGEA6、Bcl-2蛋白表達水平低于si-Ctrl組(MAGEA6：0.33±0.04vs. 0.69±0.06，P<0.05；Bcl-2：0.37±0.04vs. 0.54±0.06，P<0.05)，Bax蛋白表達水平高于si-Ctrl組(0.62±0.05vs. 0.28±0.04，P<0.05，圖4)。

圖4 敲減MAGEA6表達對胃癌細胞中MAGEA6、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響(Western blotting)Fig.4 Effect of knockdown of MAGEA6 expression on the expression of MAGEA6, Bcl-2 and Bax proteins in gastric cancer cells(Western blotting)

2.5 敲減MAGEA6表達對胃癌細胞自噬的影響

Western blotting檢測結果顯示，si-MAGEA6組自噬相關蛋白Atg-5、Beclin 1表達水平以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于si-Ctrl組(Atg-5：0.41±0.08vs. 0.19±0.04，P<0.05；Beclin 1：0.24±0.04vs.0.12±0.03，P<0.05；LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ：0.61±0.08vs. 0.33±0.07，P<0.05)，p62蛋白表達水平低于si-Ctrl組(0.24±0.05vs. 0.43±0.05，P<0.05，圖5)。

圖5 敲減MAGEA6表達對自噬相關蛋白表達的影響(Western blotting)Fig.5 Effect of knockdown of MAGEA6 expression on the expression of autophagy-related proteins (Western blotting)

為進一步明確敲減MAGEA6表達對胃癌細胞自噬的影響，利用電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察胃癌細胞內自噬小體形成情況及自噬流的變化。電鏡觀察顯示，與si-Ctrl組比較，si-MAGEA6組胃癌細胞胞質內自噬小體明顯增多(圖6)；激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，敲減MAGEA6表達可促進胃癌細胞內自噬小體與溶酶體形成自噬溶酶體，提示胃癌細胞自噬增強(圖7)。

圖6 電鏡觀察敲減MAGEA6表達對胃癌細胞自噬小體形成的影響Fig.6 Electron microscopic observation the effect of knockdown of MAGEA6 expression on the autophagosome formation in gastric cancer cells

圖7 激光共聚焦顯微鏡觀察敲減MAGEA6表達后胃癌細胞自噬流的變化Fig.7 Laser confocal microscope observation the changes of autophagic flux after knockdown MAGEA6 expression of gastric cancer cells

2.6 敲減MAGEA6表達對胃癌細胞Akt/mTOR信號通路的影響 Western blotting檢測結果顯示，si-Ctrl組和si-MAGEA6組Akt、mTOR總蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；與si-Ctrl組相比，si-MAGEA6組p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平明顯降低[p-Akt：0.47±0.07vs. 0.90±0.07，P<0.05；p-mTOR：0.34±0.04vs. 0.58±0.04，P<0.05，圖8]。

圖8 敲減MAGEA6表達對胃癌細胞Akt、mTOR、p-Akt、p-mTOR蛋白表達的影響(Western blotting)Fig.8 Effect of knockdown of MAGEA6 expression on Akt, mTOR, p-Akt, and p-mTOR protein expression of gastric cancer cells(Western blotting)

3 討 論

胃癌為消化道的惡性腫瘤，其發病率較高，我國胃癌患者約占全球胃癌總數的50%，嚴重威脅著人民群眾的健康。我國東部地區的胃癌發病率高于西部地區，吸煙、亞硝酸鹽和酒精攝入均能增加胃癌的患病風險，且大部分患者在發現時已處于Ⅲ期或Ⅳ期[9-11]。胃癌晚期進行手術治療、放療和化療已很難提高生存率，且癌細胞容易對化療藥物產生耐藥性[11-12]。因此，闡明胃癌發生和發展的分子機制對于研發有效的治療藥物具有重要意義。MAGE家族首先在黑色素瘤患者中發現，是黑色素瘤相關抗原[5]。MAGE超家族包含60多個基因，具有A、B和C三個亞家族，在進化中高度保守[13-15]。其中MAGEA具有腫瘤特異性，可針對其研制腫瘤疫苗[16]。研究發現，MAGEA對腫瘤的發生發展和藥物抵抗具有重要作用[17]。MAGEA高表達與多種腫瘤預后不良有關[18-19]。本研究發現，MAGEA6在胃癌組織中高表達，且高表達MAGEA6的胃癌患者總體生存率低于低表達的患者。MAGEA6高表達與年齡及臨床分期有關，提示MAGEA6可作為胃癌潛在的診斷和預后評估標志物以及治療靶點。

研究發現，在腫瘤的發生過程中細胞凋亡的自我調節被打破。Bcl-2和Bax是調節細胞凋亡的關鍵蛋白，Bcl-2/Bax比值增高可抑制細胞凋亡，比值降低則可促進細胞發生凋亡[20]。細胞自噬是維持細胞內環境穩態的重要自我調節機制，對于細胞行為學和功能影響較大，與腫瘤的發生和發展關系密切[21]。調控自噬的分子信號通路十分復雜，當自噬發生時，胞質型LC3(LC3-Ⅰ)可酶解掉一小段多肽轉變為膜型(LC3-Ⅱ)，在膜內外表達的LC3-Ⅱ會脫離自噬體而進入細胞質，所以LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值可反映細胞自噬的水平[22-24]。Beclin-1是自噬小體形成的關鍵蛋白，可啟動細胞自噬，上調Beclin-1可誘導細胞自噬的發生[25-26]。在內質網應激過程中，自噬可消化對細胞生存無意義的蛋白質來維持內質網的功能，進而減少內質網應激誘發的凋亡，而過度自噬可加速細胞自噬性細胞死亡[27]。本研究發現，敲減MAGEA6的表達可抑制胃癌細胞的增殖能力，促進胃癌細胞凋亡，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，促進凋亡蛋白Bax的表達；此外還可促進胃癌細胞自噬。這與既往研究中MAGEA6參與調控多種癌細胞自噬水平的結果一致[8,16]。但敲減MAGEA6促進胃癌細胞凋亡是否與其增強胃癌細胞自噬有關仍需進一步探討。

Akt/mTOR信號通路主要由PKB/Akt和mTOR兩個作用分子組成。Akt在細胞存活和凋亡中起重要作用，其Ser473位點可被PDK1磷酸化，是Akt/mTOR信號通路的中心作用分子；mTOR是Akt的下游分子，是一種營養和能量狀態的傳感器，受多種信號的調控，可通過被Akt直接或間接磷酸化而激活[28-30]。大量研究發現，腫瘤細胞自噬與Akt/mTOR信號通路關系密切。雷公藤根皮中主要的活性天然產物雷公藤紅素在腦膠質瘤細胞中可通過降低Akt/mTOR通路中p-Akt、p-mTOR的表達水平而增強細胞自噬，促進細胞凋亡[31]。3'-epi-12β-羥基脯氨酸可通過阻斷肺癌細胞中Akt/mTOR通路而誘導細胞保護性自噬，進而發揮抑制肺癌細胞生長的作用[32]。本研究發現，敲減MAGEA6后細胞自噬水平明顯升高，且Akt、mTOR磷酸化水平降低，提示si-MAGEA6抑制Akt/mTOR通路的磷酸化是其增強胃癌細胞自噬的潛在作用機制。

綜上所述，本研究結果表明，MAGEA6在胃癌組織中呈高表達，敲減MAGEA6能夠抑制胃癌細胞增殖、促進胃癌細胞凋亡，還可通過抑制Akt/mTOR通路的磷酸化而介導自噬增強。MAGEA6有望成為胃癌診斷和預后評估的特異性生物標志物以及潛在的治療靶點。但本研究未探索MAGEA6介導的自噬與凋亡的關系，也未通過體內試驗進行驗證，后續研究需建立Akt/mTOR通路高表達和低表達的胃癌細胞進行機制驗證，以為胃癌的診斷和治療提供新的途徑。