甘蔗野生近緣種遺傳多樣性的ISSR分析

徐 榮，徐永艷，何麗蓮，楊清輝，張漢堯，李富生

(1.玉溪師范學院，云南 玉溪 653100；2.西南林業大學，昆明 650224；3.云南農業大學，昆明 650201)

【研究意義】甘蔗(SaccharumofficenarumL.) 是多年生禾本科(Gramineae)高效C4植物，不僅是中國主要的糖料作物，還可用于飼料、造紙及生物質燃料的生產等。目前，甘蔗品種優良親本材料重復利用造成遺傳基礎狹窄，不可避免出現雜交近親化、網絡化，隨著距離野生種的代數越來越遠，品種生活力、適應性、抗逆性、宿根性隨著世代數增加逐漸退化[1]。【前人研究進展】為了擴大甘蔗異質性，斑茅、蔗茅、芒屬、高粱、玉米、竹屬等被各國甘蔗育種家應用于甘蔗遠緣屬間雜交。 甘蔗屬割手密具有適應性強、宿根性好、抗逆性強的優點，歷來為甘蔗遺傳改良的重要種質資源[2-4]。斑茅具有粗生、宿根性好、抗旱、抗寒、抗病、抗蟲、染色體數較少、生物量大、纖維含量高等特點[5-6]，越來越受到國內外甘蔗育種界的重視。蔗茅具有抗寒、抗旱、耐瘠、宿根性強、抗銹病等特性，且易開花、花粉量極多，也是甘蔗育種[7-8]珍貴的種質資源。甘蔗屬與蔗茅屬、芒屬、硬穗茅屬、河八王屬組成“甘蔗屬復合體”。【本研究切入點】甘蔗屬及其近緣屬種之間的系統發育關系并不完全明確。ISSR (Inter-simple sequence repeats)分子標記具有操作簡便、穩定性好的特點，已廣泛應用于物種分類、品種鑒定及遺傳多樣性等方面[9]。【擬解決的關鍵問題】對44份甘蔗野生近緣種無性系材料進行ISSR遺傳多樣性分析，以期搞清甘蔗野生近緣種間的系統發育關系，為下一步種質資源創新、培育甘蔗新品種等提供種質材料和理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料種植于云南農業大學甘蔗所野生種質資源圃，包括甘蔗近緣植物5個屬8個種共計44份無性系材料(表1)[10]。

表1 44份供試材料及來源

續表1 Continued table 1

1.2 ISSR反應體系的建立與優化及引物的篩選

試驗根據禾本科植物的特性，將篩選引物分別利用不同甘蔗野生種進行擴增，通過預試驗，建立一套甘蔗野生種的ISSR的優化反應體系及反應程序。PCR 反應體系：模板 DNA 1 μL、dNTP (10 mmol/L) 0.6 μL、引物(10 μmol/L) 2.0 μL、Mg2+1.6 μL、Taq酶(2.5 μL) 0.4 μL、加ddH2O 補齊20 μL。優化后的PCR擴增程序：預變性94 ℃ 8 min;變性 94 ℃ 60 s，退火56 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 60 s，循環40個；延伸72 ℃ 6 min，保溫16 ℃，4 ℃保存。

參考錢韋等[11]使用的26條ISSR引物序列加以改動，交由上海生工合成，在優化的反應體系條件下，最終篩選出13條(表2)擴增特異性高、條帶清晰、反應穩定的引物用于下一步分析。

表2 13對ISSR引物堿基序列

1.3 數據統計與分析

利用VILBER LOURMAT凝膠成像系統自動掃描圖像條帶，以有(計為1)或無(計為0)記錄相對遷移位置的等位基因。運用NTSYS分析Dice (Nei and Li)系數相似性，利用UPGMA 構建聚類樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 甘蔗近緣植物5屬8種44份材料的多態位點比率與分析

對44份甘蔗野生近緣種無性系供試材料進行了ISSR分析，13條引物擴增得到位點數為261個，其中有259個多態性位點，在屬的水平上99%為多態性位點，條帶長度在100～2500 bp(表3)，表明野生甘蔗近緣種屬具有較高的遺傳多樣性，對環境變化有較強的適應能力。其中,引物UBC808、UBC809擴增電泳結果見圖1～4。

表3 13對ISSR引物對44份樣品材料的擴增位點統計

圖1 引物UBC808的ISSR擴增結果(材料A1～A24)Fig.1 Results of ISSR amplification by primer UBC808(Samples：A1-A24)

圖2 引物UBC808的ISSR擴增結果(材料A25～A44)Fig.2 Results of ISSR amplification by primer UBC808(Samples：A25-A44)

圖3 引物UBC809的ISSR擴增結果(材料A1～A24)Fig.3 Results of ISSR amplification by primer UBC809(Samples：A1-A24)

圖4 引物UBC809的ISSR擴增結果(材料A25～A44)Fig.4 Results of ISSR amplification by primer UBC809(Samples A25-A44)

對44份材料按種屬統計各自的擴增條帶、多態性條帶及其多態位點比率(表4)，對比分析發現不同屬之間的多態位點比率在55.56%～98.98%，屬間多態位點比率大小順序排列為：甘蔗屬>蔗茅屬>芒屬>金茅屬>河八王屬；與總的多態位點比率相比，種屬間的多態位點比率相對小了許多，屬間差異明顯大于種間差異。不同種之間的多態位點比率在55.56%～96.91%，其中河八王屬河八王種的多態位點最低為55.56%，蔗茅屬蔗茅種的多態位點最高為96.91%，說明蔗茅屬蔗茅種具有很高的遺傳多樣性，適應環境的能力最強。以上各近緣種多態位點比率變異系數變幅較大的為甘蔗屬的割手密種，斑茅種次之，種的水平多態位點比率大小排列順序為：甘蔗屬割手密種>甘蔗屬斑茅種>蔗茅屬蔗茅種>芒屬五節茅種>金茅屬金茅種>河八王屬河八王種，其中蔗茅屬的滇蔗茅種、芒屬的金茅種樣品數量太少，不具有說服力。

表4 44份樣品材料的多態位點統計

2.2 甘蔗近緣植物5屬8種44份材料的Nei指數(h)分析

對44份供試材料用Nei & Li方法兩兩比對獲得遺傳相似系數，相似系數越大說明親緣關系越近；反之，親緣關系越遠。44份材料遺傳相似系數為0.1250 000～0.7096 774，平均為0.3818。采自西藏察隅的蔗茅材料90-31和材料90-29之間相似系數最大為0.7097，采自四川攀枝花的割手密材料91-2與井研的河八王材料83-199之間相似系數最小為0.1250，說明該兩個材料之間的親緣關系最遠(圖5)。

圖5 44份材料遺傳相似系數百分比Fig.5 The genetic similarity coefficient percentage of 44 samples

甘蔗野生近緣種屬之間的相似系數集中在0.2～0.4，占比高達70%，遺傳相似系數在0.7以上的僅占0.2%，表明各種間材料遺傳分化較大，遺傳多樣性豐富，親緣關系相對較遠。

2.3 甘蔗近緣植物5屬8種44份材料的UPGMA聚類分析

根據Nei’s遺傳距離利用UPGMA構建出甘蔗野生近緣5屬8種44個材料的UPGMA居群遺傳關系聚類圖(圖6)，12個斑茅種材料在接合線0.805處聚合，金茅的2個材料與斑茅的親緣關系更近，在接合線0.775處10個割手密材料聚合，斑茅、割手密、金茅在接合線0.74處聚合，5個五節茅材料在接合線0.755處聚后同川茅90-27在0.745處聚在一起，完全符合芒屬的傳統分類，11個蔗茅材料在接合線0.761處聚合后同2個河八王材料于接合線0.734處聚合在一起，芒屬、蔗茅屬、河八王屬在0.723處聚在一起，說明蔗茅屬、芒屬、河八王屬之間的關系更親近，而割手密、斑茅、金茅之間的關系更近，如果斑茅劃歸甘蔗屬，那么金茅也要劃歸甘蔗屬，該試驗的聚類結果同傳統分類基本吻合。采自同一地理區域(西藏察隅)編號30、32的2個蔗茅材料緊密聚合在一起，說明遺傳距離跟地理距離密切相關。

圖6 44份材料的UPGMA聚類結果Fig.6 UPGMA clustering results of 44 samples

44份材料中的17份材料共擴增得到21條特異帶，除個別有2條特異帶外，基本每個材料只擴增到1條特異帶，如采自云南潞西的斑茅材料89-8有2條特異帶，UBC808的200 bp處和UBC855的990 bp各有1條，通過特異條帶，有助于跟蹤識別雜交后代中究竟有哪個種的血緣。

3 討 論

基于ISSR分子標記對44份甘蔗野生近緣種材料按種間、割手密、斑茅3個層次進行遺傳多樣性分析，多態性位點百分率在屬的水平上高達99%，表明野生甘蔗近緣種屬具有較高的遺傳多樣性，對環境變化有較強的適應能力，為甘蔗的遺傳育種改良提供了理論依據。種間水平以蔗茅屬蔗茅種的多態位點最高，為96.91%，說明其具有很高的遺傳多樣性，適應環境的能力最強。研究結果表明屬間的多態性明顯高于種間的多態性，這與樣本數量有很大關系，一般來講樣本數量越多，則多態位點的比率越高，樣本數量少，則多態位點的比率越低。同時，研究發現含(AC)n、(CT)n、(CA)n、(GA)n序列的ISSR引物擴增多態性較高，暗示著甘蔗野生近緣種基因組中(AC)n、(CT)n、(CA)n、(GA)n含量豐富。甘蔗野生近緣5屬8種44個材料聚類結果顯示，不同實驗材料首先按照種聚合在一起，隨后按屬接合在一處，割手密、斑茅、金茅之間的關系更近，而蔗茅屬、芒屬、河八王屬之間的關系更為親近，該聚類結果與傳統分類基本吻合，說明ISSR分子標記可以用于種間遺傳多樣性分析。種內水平的聚類分析表明地理距離近的材料其遺傳距離也近，而與生境、海拔等因素則未表現出密切的相關性。值得注意的是編號29采自美國的IND81-46蔗茅單獨成一類。

斑茅的分類地位在國內甘蔗界和植物學界并沒有統一，有的將其歸入甘蔗屬，有的則將其歸入蔗茅屬，甚至建議立為單種屬[12]。 在國外，早期斑茅歸類于甘蔗屬，學名為SaccharumarundinaceumRetz。直到1925年Jeswiet提出將斑茅歸類為蔗茅屬，學名為Erianthusarundinaceum(Retz) Jeswiet[13]， Dtn-R 和 Rao[14]研究進一步驗證了Jeswiet的觀點。1972年Grassl建議把斑茅和蔗茅屬內的13個種劃分出來成立新的Ripidium屬。Daniels和Roach于1987年將Ripidium屬重新劃歸蔗茅屬，歸類為蔗茅屬的一個組(Erianthussect.Ripidium)，現在國際上己基本得到承認[15]。周耀輝認為國外甘蔗界將斑茅歸入蔗茅屬(Erianthus) 已沒有什么爭議[16]。但查閱相關文獻及權威網站發現，包括NCBI都將斑茅統一歸類在甘蔗屬內，學名通用為SaccharumarundinaceumRetz。在國內，斑茅的分類的確不統一，首先是國內沒有Ripidium組的6個種，國內分布的4個蔗茅屬原種中滇蔗茅、蔗茅與斑茅差異較大，無法據此確定斑茅的分類地位。周耀輝[16]將甘蔗屬、蔗茅屬某些種分別與斑茅進行形態學比較，建議斑茅歸類在蔗茅屬更加客觀合理，而不應該歸類于甘蔗屬。廖兆周等利用過氧化物酶同工酶的方法對甘蔗屬5個種216個材料進行分析，發現斑茅的同工酶帶數、遷移率及其分布規律均異于甘蔗屬其他4個種，認為斑茅劃歸甘蔗屬不合理[17]。余愛麗等[18]利用ISSR標記分析了甘蔗屬、斑茅、蔗茅和五節芒的親緣關系，表明斑茅與蔗茅的親緣關系比甘蔗屬更近一些。通過研究表明，芒屬、蔗茅屬、河八王屬之間的關系更近，而割手密、斑茅、金茅之間的關系更近。根據研究結果將斑茅歸入甘蔗屬較為合理。

4 結 論

利用ISSR分子標記按照割手密種內、斑茅種內及種間3個層次對44份甘蔗野生近緣種材料進行遺傳多樣性分析，從26條ISSR引物中篩選出13條特異引物，44個種間材料的多態性百分率為99%，擴增出的261條條帶中259條為多態性條帶；種間多態性為甘蔗屬割手密種>甘蔗屬斑茅種>蔗茅屬蔗茅種>芒屬五節茅種>金茅屬金茅種>河八王屬河八王種；44個種間材料UPGMA聚類結果基本符合形態學分類，12份斑茅材料在0.805處聚合，斑茅和割手密材料在0.775處聚合，采自西藏察隅編號A30、A32的蔗茅緊密聚合，蔗茅屬、芒屬、河八王屬之間關系更近，與甘蔗屬在0.73處聚合在一起，種間遺傳相似系數在0.125～0.710。研究結果可為甘蔗遺傳育種、引種等提供理論上的指導。