紫金龍營養器官組織結構和組織化學定位研究

朱新焰，楊維澤，楊紹兵，曩興麗，楊竹雅，季鵬章，張金渝

(1.云南省農業科學院藥用植物研究所，昆明 650223；2.云南農業大學熱帶作物學院，云南 普洱 665099；3.云南中醫藥大學，昆明 650500)

【研究意義】紫金龍[Dactylicapnosscandens(D.Don) Hutch.]是罌粟科 (Papaveraceae)紫金龍屬多年生藤本植物，藥用其根，主產于中國云南、四川、廣西和西藏等西南省區[1]。具有鎮痛、止血、消炎等功效，主要用于治療牙痛、外傷腫痛、胃痛等各類疼痛及血崩、內傷出血、跌打損傷等病癥[2-3]。紫金龍是中國民族民間傳統藥材，藥用歷史悠久，功效確切。由于用量較大，野生資源采挖嚴重，藥材常有參偽現象[4-5]。因此，有必要對紫金龍的藥用部位及莖、葉等器官進行研究，探索各器官化學成分的種類及分布量，為資源開發利用提供依據。[6-7]。【前人研究進展】對紫金龍的研究主要在資源調查、栽培技術及根的化學成分研究等方面[8-11]，對紫金龍營養器官組織結構及組織化學定位的系統研究尚未見報道。【本研究切入點】目前，紫金龍以根入藥，莖、葉等非藥用部位常遭廢棄，對資源造成了比較嚴重的浪費。利用組織顯微及化學定位方法，從而分析紫金龍各營養器官的顯微組織結構和黃酮、多糖、生物堿及皂苷等成分在不同器官的各組織中的儲存與分布特征，從而充分利用資源，減少相關化學物質的流失[12]。【擬解決的關鍵問題】揭示紫金龍不同器官的顯微構造特征和主要化學物質的分布積累特征，為紫金龍資源的保護和可持續利用提供理論依據[13]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

紫金龍樣品采自保存于云南省農業科學院滇中藥用植物資源圃，經云南中醫藥大學楊竹雅副教授鑒定為紫金龍[Dactylicapnosscandens(D.Don) Hutch.]，樣品標本均保存于云南省農業科學院藥用植物標本室。

試劑：乙醇、品紅、香草醛、冰醋酸、高氯酸、亞硫酸氫鈉、偏重亞硫酸鈉、高碘酸、氫氧化鈉、堿式硝酸鉍、碘化鉀等試劑均為分析純，水為純化水。

儀器：HS-2026型生物組織切片機；KH5200DE型數控超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；TGL-16M離心機(湖南湘儀儀器有限公司)；AR124CN電子分析天平(奧豪斯上海有限公司)；DHG-9023A電熱恒溫鼓風干燥箱；Nikon 80i型顯微鏡(日本尼康公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 器官顯微構造 各營養器官樣品均采自相同生長年限的紫金龍植株，先用FAA液將各器官組織進行固定，再用乙醇梯度脫水，將各器官分別進行徒手切片和石蠟制片，各切片厚度約為12～30 μm，制片后分別在不同顯微鏡倍數下觀察并拍照記錄[14-15]。

1.2.2 組織化學染色及定位 制片：分別對紫金龍的3個營養器官進行切片、制片，各器官樣品分別選取10～15張組織結構完整、無碎片及細胞清晰的切片分別進行黃酮、生物堿、多糖及皂苷等物質的染色和定位后，于不同倍數顯微鏡下觀察并分析結果。

顯色反應及物質定位：依據黃酮、生物堿、多糖及皂苷類物質的特征顯色反應，分別以5%NaOH水溶液、改良碘化鉍鉀試劑、高碘酸—希夫試劑及等量的5%香草醛—冰醋酸和高氯酸試劑對黃酮、生物堿、多糖及皂苷類物質進行顯色和定位。4種物質與上述相應顯色試劑反應后分別顯黃色、橙黃色或橙紅色、紅色至紫紅色、粉紅色至紅色[16-17]。

1.2.3 顯微觀察方法及數據分析 選取紫金龍根、莖、葉3種營養器官的10張顯色切片，對各切片的不同組織區域、細胞進行觀察，各區域均選取6個不同視野；并使相同倍數的觀察面積相等，統計不同組織各視野中的染色顆粒狀物質的數量，取平均值。根據組織中著色顆粒物質的數量和密度等，依次劃為6個等級，其中“/”為未見顯色，顯色程度從低到高分別用1～5個“+”表示[18-20]。

2 結果與分析

2.1 紫金龍根的組織構造及組織化學定位

2.1.1 顯微構造特征 木栓層為2～4列(圖1-A)，類長方形或不規則形，有的細胞內可見棕色物質。皮層較寬，薄壁組織中可見含黃色揮發油的乳汁管，薄壁細胞內含淀粉粒。形成層環較明顯。射線貫穿木質部及韌皮部。木質部可見木纖維，導管直徑約26～140 μm。薄壁細胞內有大量淀粉粒，直徑約5～37 μm，臍點類型多樣，復粒多由2～4分粒組成。

2.1.2 物質定位及分布積累特征 黃酮：皮層薄壁細胞及木質部組織細胞顯色較深(表1，圖1-B)，乳汁管及韌皮部組織中黃色較淺，黃酮類成分分布較少。各組織黃酮分布量為皮層>木質部>韌皮部。

表1 紫金龍根的組織中4種化學成分分布多度

生物堿：大量皮層薄壁組織和韌皮部組織細胞顯橙黃色(圖1-C)，分布有極多的生物堿類成分，而木質部及其它組織細胞則染色較淺。各組織生物堿分布數量為皮層>韌皮部>木質部。

多糖：皮層及木質部組織多顯紫紅色(圖1-D)，多糖大量儲藏在皮層及木質部組織中，韌皮部可見紅色顆粒及團塊，木栓層有少量分布，各組織多糖分布數量為皮層>木質部>韌皮部。

皂苷：皂苷較多分布在皮層組織中(圖1-E)，其次為韌皮部組織細胞，2種組織均多顯紅色，木栓層及木質部有少量分布。各組織皂苷分布數量為皮層>韌皮部>木質部。

A：根的組織結構圖；B：根中黃酮分布;C:根中生物堿分布;D:根中多糖分布;E: 根中皂苷分布。a：皮層(40×)；b：維管束(40×)；Pa：基本薄壁組織；Co：皮層；Vb：維管束；Ph：韌皮部；Xy：木質部；Fl：黃酮；Al：生物堿；Po：多糖；Sa：皂苷A: Tissue structure of roots; B: Distribution of flavonoids in roots; C: Distribution of alkaloids in roots; D: Distribution of polysaccharides in roots; E: Distribution of saponins in roots.a: The cortex (40×); b:The vascular bundles (40×); Pa: Parenchyma; Co: Cortex; Vb: Vascular bundle; Ph: Phloem; Xy: Xylem; Fl: Flavone; Al: Alkaloid; Po: Polysaccharide; Sa: Saponin圖1 紫金龍根的組織構造及組織化學定位Fig.1 Tissue structure and histochemical localization in roots of Dactylicapnos scandens

2.2 紫金龍莖的組織構造及組織化學定位

2.2.1 顯微構造特征 表皮細胞1～2列(圖2-A)，類長方形、類正方形、外壁光滑。皮層細胞多呈不規則多邊形或類圓形，細胞間隙明顯。表皮內側可見1列含葉綠體的類圓形或不規則形薄壁細胞。維管束外韌型、環狀排列。乳汁管散在于皮層及韌皮部的薄壁組織中，內含黃色乳汁狀分泌物。木質部導管多為徑向排列，偶散在，直徑約4.3～35 μm。木纖維多成群分布，直徑約1.8～4.6 μm。髓部較寬，多中空。

2.2.2 物質定位及分布積累特征 黃酮：部分皮層薄壁組織及韌皮部組織細胞顯黃色(圖2-B)，這2種組織是黃酮類成分的主要分布場所，表皮、乳汁管及木質部細胞可見少量分布。各組織黃酮分布數量為皮層>韌皮部>木質部(表2)。

表2 紫金龍莖的組織中4種化學成分分布多度

生物堿：生物堿大量分布在皮層組織中，染色多呈橙黃色顆粒狀或團塊狀(圖2-C)。韌皮部及木質部組織細胞及細胞間隙染色多呈橙紅色或橙色，表皮細胞則少數染色。各組織生物堿分布數量為皮層>韌皮部>木質部。

多糖：多糖在整個組織均有分布，以皮層組織細胞染色最深(圖2-D)，韌皮部及木質部組織細胞內及細胞壁多數顯紅色或紫色。表皮細胞亦有分布。各組織多糖分布數量為皮層>韌皮部≥木質部。

A：莖的組織結構；B：莖中黃酮分布；C：莖中生物堿分布；D：莖中多糖分布；E：莖中皂苷分布。a：皮層(40×)；b：維管束(40×)；Ep：表皮；Pa：基本薄壁組織；Co：皮層；Vb：維管束；Ph：韌皮部；Xy：木質部；Fl：黃酮；Al：生物堿；Po：多糖；Sa：皂苷A : Tissue structure of stem; B: Distribution of flavonoids in stems; C: Distribution of alkaloids in stems; D: Distribution of polysaccharides in stems; E: Distribution of saponins in stems.a: The cortex (40×); b:The vascular bundles (40×); Ep: Epidermis; Pa: Parenchyma; Co: Cortex; Vb: Vascular bundle; Ph: Phloem; Xy: Xylem; Fl: Flavone; Al: Alkaloid; Po: Polysaccharide; Sa: Saponin圖2 紫金龍莖的組織構造及組織化學定位Fig.2 Tissue structure and histochemical localization in stems of Dactylicapnos scandens

皂苷：靠近表皮的2～3層皮層細胞顯紫紅色(圖2-E)，顯示該區域有大量皂苷分布，韌皮部及木質部組織細胞中亦有一定量分布，表皮細胞可見少量分布。各組織皂苷分布數量為皮層>韌皮部>木質部。

2.3 紫金龍葉的組織構造及組織化學定位

2.3.1 顯微構造特征 兩面葉表皮均外被角質層；表皮細胞長圓形或近長方形(圖3-A)。主脈處的表皮細胞壁均略增厚；此處上、下表皮內側均分布1～2層厚角組織細胞。海綿組織可見，柵欄組織細胞排列緊密。主脈維管束為外韌型，木質部導管徑向排列，射線明顯。側脈維管束外被1層薄壁鞘細胞。偶見細小草酸鈣結晶散在于表皮、葉脈及葉肉薄壁組織細胞中。

2.3.2 物質定位及分布積累特征 黃酮：葉片黃酮儲存量較少(表3，圖3-A)，主要在葉肉薄壁細胞中，木質部組織顯黃色。表皮及韌皮部分布則極少。葉片各組織黃酮分布數量依次為為葉肉>維管束>表皮(因葉片維管組織不甚發達，所以將韌皮部、木質部等相關組織進行綜合分析，不再細分，后同)。

表3 紫金龍葉的組織中4種化學成分分布多度

生物堿：在葉肉細胞中多數呈橙黃色滴狀、顆粒狀或團塊狀(圖3-B)。木質部組織細胞則多呈橙紅色。韌皮部及表皮組織染色極淺或未見染色。各組織生物堿分布數量為葉肉>維管束>表皮。

多糖：葉肉細胞中多糖多呈紫色、紫紅色顆粒狀(圖3-D)，維管束組織則多顯紅色。表皮細胞顯色較淺。葉片除上下表皮分布外，多糖在維管束及葉肉組織細胞中分布極多，各組織多糖分布數量為葉肉>維管束>表皮。

A：葉的組織結構；B：葉中黃酮分布；C：葉中生物堿分布；D：葉中多糖分布；E：葉中皂苷分布。a：皮層(40×)；b：維管束(40×)；Ep：表皮；Pa：基本薄壁組織；Co：皮層；Vb：維管束；Ph：韌皮部；Xy：木質部；Me：葉肉細胞；Fl: 黃酮；Al：生物堿；Po：多糖；Sa：皂苷A: Tissue structure of leaves; B: Distribution of flavonoids in leaves; C: Distribution of alkaloids in leaves; D: Distribution of polysaccharides in leaves; E: Distribution of saponins in leaves.a: The cortex (40×); b:The vascular bundles (40×); Ep: Epidermis; Pa: Parenchyma; Co: Cortex; Vb: Vascular bundle; Ph: Phloem; Xy: Xylem; Me: Mesophyll cell；Fl: Flavone; Al: Alkaloid; Po: Polysaccharide; Sa: Saponin圖3 紫金龍葉的組織構造及組織化學定位Fig.3 Tissue structure and histochemical localization in leaves of Dactylicapnos scandens

皂苷：葉中皂苷分布較少(圖3-E)，木質部組織細胞顯淺紅色，葉肉偶見粉紅色滴狀皂苷類物質，在表皮及韌皮部組織細胞中則分布很少。各組織皂苷分布數量為維管束>葉肉>表皮。

2.4 紫金龍3種營養器官黃酮、生物堿、多糖、皂苷等4類物質相對分布量及平均分布密度比較

在相同觀察視野面積下，對各營養器官內4種物質的分布量進行分析(表4)，生物堿與皂苷類物質在根、莖、葉中的平均分布量均呈遞減趨勢，黃酮類物質在葉中分布量較少，根與莖中則相似。多糖類物質在根中分布較多，莖、葉中分布量相似。

表4 紫金龍各器官4種化學成分分布量分析

3 討 論

通過對紫金龍3種營養器官的組織構造的切片觀察與分析，測量并闡明了導管、纖維、維管束、乳汁管、淀粉粒、柵欄組織等組織細胞的形態、大小或結構等特征[21]。通過組織化學定位及分析，初步明確了紫金龍4種化學成分的組織分布、相對儲存量和分布密度等特征。根和莖的皮層較為寬廣，4種化學成分在薄壁組織細胞中分布較多。維管束組織中也有不同程度的分布量。這與植物基本薄壁組織儲存物質和維管束運輸物質的基本功能相統一[22-23]。

關于紫金龍中生物堿類化學成分的研究比較多，但有關化學成分及藥理活性等方面尚待深入研究。紫金龍葉和莖等非藥用部位占其總生物量的20%～25%，并且兩者的黃酮、生物堿、多糖及皂苷類等成分均有不同程度的分布量，而這些非藥用部位常被廢棄。隨著以紫金龍為制藥原料的需求量的攀升，其藥材價格也在不斷上升，導致紫金龍野生資源迅速衰減，故要加強對非藥用部位的開發利用，提高資源綜合利用效率[12,23]。

4 結 論

研究明確了紫金龍根、莖及葉3種營養器官的顯微組織構造類型及特征，可以作為紫金龍正品基源植物、藥材及飲片的鑒別依據；根、莖、葉3種營養器官均有黃酮、生物堿、多糖及皂苷的分布，但各自分布的部位及組織細胞有所不同。研究結果可為紫金龍資源的開發利用提供參考依據。這對減少資源浪費、保護及合理開發資源具有重要意義。