南瓜蚜傳黃化病毒基因組遺傳多樣性分析

崔正秀，孫柳清，肖苗苗，王燕飛,羅永平，赫 娟，玉山江·麥麥提，陳 偉

(1. 山西師范大學生命科學學院，山西 臨汾 041000；2. 新疆農業科學院,烏魯木齊 830052)

【研究意義】新疆特殊的地理位置以及氣候特征，使其成為國內重要的甜瓜生產基地。隨著新疆甜瓜種植面積不斷增大，甜瓜產量日益增加，已成為新疆農業生產的重要經濟增長點。病毒病一直是影響新疆甜瓜種植的重要病害，受病毒病侵染的甜瓜植株會出現葉片畸形、花葉、黃化等多種癥狀，最終導致甜瓜果實品質嚴重下降、產量大大降低。因此明確CABYV的發生情況、種群結構和遺傳多樣性，對該病毒的有效預防和控制具有重要意義。【前人研究進展】國內許多學者對新疆侵染瓜類作物的病毒進行鑒定發現，侵染新疆甜瓜的病毒主要有西瓜花葉病毒(WMV)、黃瓜花葉病毒 (CMV)、煙草壞死病毒 (TNV)、甜瓜葉脈壞死病毒 (MVNV)和小西葫蘆黃化花葉病毒 (ZYMV)等[1-2]。有研究證實在新疆喀什地區大面積暴發的甜瓜黃葉病病原主要為南瓜蚜傳黃化病毒[2]。 南瓜蚜傳黃化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus, CABYV)是侵染葫蘆科作物的重要的病毒，寄主包括甜菜、萵苣、蠶豆等[3-5]。在1992年的法國，南瓜蚜蟲黃化病毒在南瓜和黃瓜植物中第一次被發現[6]，后來在西班牙、突尼斯和意大利等國也報道了 CABYV的發生。該病毒為正義單鏈病毒(+ssRNA)，屬于黃癥病毒科(Luteoviridae)馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)，具有直徑為25～30 nm的正二十面體球形病毒粒子，全長約5.7 kb，被約200 nt的非編碼內部區域(IR)分成兩部分[7]。開放閱讀框0、1和2由基因組RNA表達，分別編碼P0 蛋白、P1蛋白和P1-P2融合蛋白，其中，P1-P2融合蛋白是ORF1在翻譯過程中C末端發生核糖體移碼的結果。而其它3個閱讀框(ORF3、4和5)由亞基因組RNA表達，ORF3編碼P3外殼蛋白，該蛋白參與病毒在植物體內的傳播和病毒組裝，ORF4和ORF5編碼運動蛋白P4和蚜蟲傳播病毒所需的通讀蛋白[8]。CABYV局限在寄主植物的韌皮部組織，主要通過蚜蟲(棉蚜和桃蚜)以循環、非繁殖的方式傳播，可以引起葉片的黃化和增厚，包括最初的褪綠損傷，隨后全葉變黃和老葉增厚，到生長季結束時，多達100%的植物出現黃變癥狀[9]，造成田間植株約減產50%。【本研究切入點】CABYV在新疆甜瓜葉片上可引起嚴重的病害癥狀，對該病毒進行檢測及明確其與不同分離物的遺傳多樣性有重要意義。【擬解決的關鍵問題】對在新疆阿克蘇市隨機采集的疑似感染CABYV的120份甜瓜葉片采用RT-PCR進行檢測，明確其發生率并克隆CABYV基因組，并用生物信息技術對從不同國家和宿主中分離到的CABYV序列進行分子變異分析，為明確該病毒病在田間發生的流行規律和制定長期可持續防控策略提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2019年，對在新疆阿克蘇市采集的120份新鮮甜瓜葉片進行RT-PCR鑒定。

1.2 引物設計

從NCBI網站中獲得從甜瓜中分離到的CABYV全基因組序列(登錄號為KR231963.1)，運用Primer 5.0進行引物設計，引物序列、產物大小如表1所示。

表1 擴增CABYV的引物

1.3 RNA提取和RT-PCR擴增與測序

根據王燕飛等[10]的方法進行總RNA提取、RT-PCR和轉化大腸桿菌并篩選陽性克隆測序。

1.4 系統進化樹分析

通過NCBI 網站進行 CABYV的全基因組序列的 BLAST比對，獲得 23條與本研究相似的序列(來自不同的國家和寄主)，23個CABYV分離物的完整核苷酸數據如表2所示。使用DNAMAN進行核苷酸序列比對，采用MEGA 7.0中的鄰接法構建CABYV全基因組的系統進化樹，自展值為1000，去掉低于50%的進化樹分支。

表2 23個CABYV完整的核苷酸數據

續表2 Continued table 2

1.5 遺傳多樣性分析

運用DnaSP 軟件計算平均成對核苷酸多樣性(π)，分離位點的數量(S)，非同義突變頻率(Ka)，同義突變頻率(Ks)，以及非同義突變與同義突變的比率(Ka/Ks)。若Ka/Ks>1，則認為有正選擇效應。若Ka/Ks=1，則認為存在中性選擇。如果Ka/Ks<1，則認為有純化選擇作用。進一步運用該軟件進行Tajima’s D，Fu & Li’s D和Fu & Li’s F的中性檢測來判定種群所面對的多樣性。其中，Tajima’s D測驗主要是在多態位點上對比例進行測定；Fu & Li’s D是在單位點突變的基礎上檢測數量差異和總體位點突變的數量差異；Fu & Li’s F是計算單位點突變與兩兩序列差異造成的平均值。

1.6 重組分析

采用重組檢測程序RDP v.4.31軟件對24個CABYV分離物進行重組分析，使用方法包括RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan和3Seq。其中接受至少5種不同方法檢測到的P<10-6的重組事件為可靠結果。

2 結果與分析

2.1 CABYV的鑒定情況

新疆阿克蘇市采集的120份哈密瓜葉片經RT-PCR檢測有38份樣品為 CABYV陽性。38份CABYV陽性樣品測序后通過BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線分析發現，37 個CABYV分離物序列同在線CABYV的核苷酸和氨基酸一致率均為100%，有1個分離物(命名為CABYV-2)與已報道的CABYV分離物在核苷酸和氨基酸水平上均有差異，因此確定CABYV-2是1個新的CABYV分離株(表2)。

2.2 CABYV的基因組結構

在38個CABYV陽性樣品中分離到1個新的分離株(CABYV-2)，該分離物的全基因組長5497 bp，編碼6個開放閱讀框，非編碼的內部區域(199 nt)被分為近5’端和近3’端兩個區域(圖1)。其中5’和3’非翻譯區分別長為20 和165 nt，近5’端的開放閱讀框ORF0編碼239個氨基酸的P0蛋白，該蛋白是南瓜蚜傳黃化病毒基因組編碼的基因沉默抑制子，可能參與了植物防御機制PTGS的抑制[4]。ORF1編碼P1蛋白，其氨基酸序列與絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列相似。ORF2編碼P1-P2功能蛋白，并具有RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)的典型氨基酸基序。近3’端的開放閱讀框(ORF3～ORF5)分別編碼P3外殼蛋白，P4運動蛋白和P3-P5通讀蛋白。

圖1 CABYV的全基因組結構Fig.1 The genome structure of CABYV

2.3 系統進化樹分析

系統進化樹分析結果表明24個分離株被分為 2個分支(圖2)。分支1含有21個分離株，這些分離株均來自亞洲，其中17個來自韓國，3個來自中國，1個來自日本。21個分離物株中，從黃瓜、葫蘆、南瓜得到的分離株均有1個，其余序列全部從甜瓜中分離得到。本研究中的分離株CABYV-2與分離株CY3(KR231942.1)聚在一起，屬于分支1。分支2包括3個分離株，這3個分離株來自于歐洲(西班牙和法國)，且都從甜瓜中分離得到。這一結果初步表明遺傳變異與地理分布有關，CABYV分離株可能是由于地理因素的不同而分為2個聚集的群，進而造成了遺傳多樣性的不同。

進化樹上的彩色圓圈分別代表不同寄主的分離株，深藍色、黃色、紫色、紅色和綠色分別代表甜瓜、葫蘆、南瓜、黃瓜和本研究的分離株The color circles on the evolutionary tree represent the isolated strain from different hosts, dark blue, yellow, purple, red and green represent melon, gourd, pumpkin, cucumber and the isolated strain from this study, respectively圖2 基于24個CABYV全基因組的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 24 CABYV genomes

為進一步分析這些分離株的多樣性，本試驗采用MEGA 7.0軟件計算這24個分離株的遺傳距離，分支1和分支2內的遺傳距離分別為 0.043 和0.090，分支1與分支2間的遺傳距離為2.024，組間遺傳距離明顯大于組內。

2.4 序列相似性分析

24 個CABYV分離株的核苷酸同一性范圍為89.72%～99.44%(圖3-A)，氨基酸一致率范圍為 81.46%～98.70%(圖3-B)，呈現出較高的一致性。本研究獲得的分離株CABYV-2與序列KR231942.1的核苷酸和氨基酸的同源性都是最高的，其中核苷酸一致性為99.44%，氨基酸一致性為98.70%，與JF939812.1的核酸同源性最低，為89.72%。

圖3 24個CABYV全基因組核苷酸序列(A)和氨基酸序列(B)一致性的二維分布Fig.3 Two dimensional distributions of the consistency of nucleotide sequence (A) and amino acid sequence (B) of 24 CABYV genomes

2.5 遺傳多樣性分析

24個基因的Ka值明顯小于Ks值，即ω均小于1(表3)，說明CABYV分離物的各個基因均受到純化選擇的影響。此外，不同基因的單體型多態性值均接近1，π值在0.078～0.156，π值最高的基因是P1基因，說明該基因的變異性更大。通過Tajima’s D、 Fu&Li’s D和Fu&Li’ s F 3種檢驗，P1、P3和P4基因的檢測值為負數 (表3)，說明CABYV的種群處于擴張階段。

表3 24個不同CABYV分離株的遺傳多樣性

表4 CABYV種群差異檢驗

2.6 重組分析

為了檢測CABYV群體中是否發生了重組事件，運用RDP軟件中的7種方法分析了24個CABYV分離株的核苷酸序列。表明，在24個CABYV(序列或分離株)中有2個重組事件(表5)，且這2個重組事件 GS6 (登錄號：KR231949.1)和CABYV(登錄號：EU636992.1)均位于分支1。來自新疆的分離株EU636992.1、本研究分離株CABYV-2以及GQ221223.1都參與了重組事件的發生，且EU636992.1重組事件是在甜瓜分離株CABYV-2和南瓜分離株GQ221223.1之間發生的，這說明CABYV的重組是可以在不同的寄主之間發生的。

表5 2個CABYV重組事件

3 討 論

CABYV是導致葫蘆科作物發黃癥狀的重要病原體，在我國河北、河南、山西和陜西等地區的9種葫蘆科作物上均檢測到了CABYV病毒[11]，隨后該病毒在黑龍江、遼寧、新疆、北京、山東、浙江、安徽、湖南、云南、廣西和海南等我國25個省市的葫蘆科作物上被檢測到[12]。在韓國，已經確認CABYV感染了黃瓜和東方甜瓜[13]，此外，該病毒可與其它感染葫蘆科的病毒一起造成共同感染，增加重組病毒出現的幾率[14-16]。近年來，在我國的葫蘆科作物上也檢測到了該病毒，導致西瓜、黃瓜、南瓜等的產量和品質顯著下降[17]。本試驗的24個CABYV的不同分離株由于地理因素的差異分為2組，且兩個組之間存在較大的遺傳差異。對不同CABYV分離株的各個基因進行遺傳多樣性分析，結果表明，P1基因的核苷酸多樣性值最大，為0.237，說明P1基因的變異性更大，P3基因的π值最小，說明其遺傳穩定性高，具有高度的保守性，這可能與其功能有關[18]。中性檢驗結果大多數為負值，說明CABYVA種群處于擴張狀態。

地理隔離可能是CABYV存在高度變異的重要原因。基于24個分離株的進化樹與核苷酸一致性分析結果，由于地理因素的差異，不同CABYV分離株分為2個分支，分支1包括從中國、韓國和日本分離到的21個分離株，本研究中分離得到的CABYV-2與CY3(KR231942.1)聚在一起，屬于分支1，分支2包括3個從歐洲不同國家得到的分離株，分支1和分支2的CABYV不同分離株親緣關系較遠，這可能是由于CABYV主要通過蚜蟲傳播，很難實現遠距離傳播[2]。尚巧霞等[17]將CABYV湖北和云南分離株與國內外不同分離株進行分析后得到CABYV分子變異與地理分布有關，與本研究結果一致。進一步對分支1和分支2兩個種群進行種群差異檢驗，結果顯示2個種群間的遺傳分化指數Fst值為0.913，Kst*為0.131，Snn和Z*值分別為1.00和4.403，分支1與分支2間的遺傳距離為2.024，說明分支1與分支2之間存在較大的遺傳分化。該結果與系統發育分析結果共同說明可能是由于地理因素的不同和遺傳距離的差異造成了CABYV的遺傳多樣性的不同。

重組加劇了CABYV的變異。對于單鏈RNA病毒來說，病毒間重組是一個主要的進化方式，會對病毒種群產生直接的影響，可以擴大寄主范圍，適應新的環境，是引起病毒變異的重要因素[19]。據先前報道，重組CABYV株來自菲律賓、臺灣[20]和泰國[21]等東南亞國家，本試驗重組分析結果表明在24個分離株中有EU636992.1和KR231949.1兩個重組事件(表5)，分別來自中國和韓國，并且甜瓜分離物和南瓜分離物之間的CABYV的重組說明該病毒可能在進化的過程中侵染力越來越強，應該引起足夠的重視。

4 結 論

CABYV在我國分布廣泛且種群不斷擴展，成為瓜類植物生產的限制因素。CABYV新疆阿克蘇市分離株與韓國分離株KR231942.1親緣關系最近，與來自歐洲國家的分離株親緣關系最遠，分支1和分支2的分離株之間存在較大的遺傳差異，CABYV在不同宿主間的重組加劇了CABYV的變異，重組和負選擇可能是影響CABYV遺傳變異的重要原因。