天然辣椒堿類物質(zhì)對朱砂葉螨殺螨活性的影響

倪 婧，謝道燕，楊振國，柴建萍，江秀均

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661100)

【研究意義】朱砂葉螨(T.cinnabarinusBoisduval)屬蛛形綱(Arachnida)葉螨科(Tetranychidae)、葉螨屬(Tetranychus)。分布于世界各地，其世代周期短，繁殖力強(qiáng)，危害32科110 余種植物[1]，是世界農(nóng)林生產(chǎn)上危害較重的害螨之一，長期使用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致殘留(Residue)、抗性(Resistance)及害蟲再猖獗(Resurgence)3R問題日益突出，目前已知朱砂葉螨對90多種化學(xué)活性成分產(chǎn)生較高的抗藥性[2]，研究天然、高效、低毒、對人畜無害的環(huán)境友好型生物殺螨劑非常必要。天然辣椒堿(Capsaicin)，又名辣椒素，從辣椒的成熟果實中分離提取出來，命名為N-香草基-8-甲基-6-壬烯酰胺，分子式為C18H27NO3，相對分子質(zhì)量為305.41，是香草基胺的酰胺衍生物，由14種以上的辣椒堿同系物組成，稱辣椒堿類物質(zhì)(Capsaiciniods)，作為一種新型綠色環(huán)保型生物農(nóng)藥，具有良好的觸殺、胃毒、驅(qū)避作用[3]。美國環(huán)保局早在1991年就將辣椒堿及其制品確定為生化農(nóng)藥，并免除其在水果、蔬菜和谷物等殘留量的限制，因此以辣椒堿為基礎(chǔ)原料的綠色殺螨劑在農(nóng)林生產(chǎn)上具有十分廣泛的應(yīng)用前景。【前人研究進(jìn)展】辣椒堿類物質(zhì)在醫(yī)藥領(lǐng)域及提取工藝改進(jìn)方面有較多研究和應(yīng)用，在有害生物防控領(lǐng)域辣椒堿作為驅(qū)避劑，添加到電線、電纜等防護(hù)材料及滴灌帶制作材料中防止老鼠、白蟻等啃咬破壞[4-5]；還替代有毒的有機(jī)錫、有機(jī)氯等添加到防污涂料中，涂布于船舶、海上建筑物及海水養(yǎng)殖器具表面，能有效驅(qū)避藤壺、藻類、貝類、軟體動物等海洋附著生物[6]。在農(nóng)業(yè)病蟲害防控領(lǐng)域，辣椒堿對芒果炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、三七根腐菌(Cylindrocarpondestructans)、番茄早疫菌(Alternariasolani)、番茄灰霉菌(Botrytiscinerea)、白菜黑斑菌(Alternariabrassicae)、玉米赤霉菌(Fusariumgraminearum)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)等病原菌有不同程度的抑制作用[7]。辣椒堿田間推薦劑量300倍稀釋液對桑褐斑病的最高防效為44.58%，而甲基硫菌靈1000倍稀釋液最高防效僅為0.04%，辣椒堿有較好的抑菌作用，且對家蠶的生長發(fā)育、繭層量、健蛹重量等沒有顯著影響[8]。辣椒堿濃度大于8.0 mg/mL時，對赤擬谷盜和谷蠹均有較好的驅(qū)避、拒食作用[9]。辣椒堿對防治蚜蟲(Aphidoidea)、小菜蛾(Xylostella)、粉虱(Aleyrodidae)、東方黏蟲(Mythimnaseparata)、小綠葉蟬(Empoascaflavescens)、豆葉甲(Ceratomatrifurcata)、六點黃蜘蛛(Eotetranychussexmaculatus)、二斑葉螨(Tetranychusurticae)等也有研究[10-13]。但由于天然辣椒堿類物質(zhì)對農(nóng)業(yè)病蟲害的防治速效性沒有化學(xué)農(nóng)藥好，且特有的辛辣嗆鼻氣味對田間噴霧操作要求較高，故近年對生物農(nóng)藥領(lǐng)域應(yīng)用研究報道較少。【本研究切入點】研究表明在安全劑量范圍內(nèi)其對家蠶的生長發(fā)育沒有顯著影響，可適用于桑園防控褐斑病[8]，但該類物質(zhì)對桑園朱砂葉螨殺螨活性及對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、羧酸酯酶等解毒代謝酶活性影響的相關(guān)研究報道較少見，在桑園防控應(yīng)用方面缺乏參考資料。【擬解決的關(guān)鍵問題】明確辣椒堿類物質(zhì)對朱砂葉螨各發(fā)育階段的殺螨效率及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶對其解毒代謝響應(yīng)，為更好的利用、開發(fā)以辣椒堿類物質(zhì)為基礎(chǔ)原料的生物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)，為桑園病蟲害綠色防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

朱砂葉螨2000年釆自重慶市北碚區(qū)野外桑樹，在智能人工氣候培養(yǎng)箱(25±1) ℃，RH 60%～80%，光周期L∶D=14 L∶10 D條件下，不噴施任何藥劑，用盆栽豇豆苗繼代飼養(yǎng)，長期培養(yǎng)箱飼養(yǎng)后檢測其對多種農(nóng)用殺螨劑抗性極低，視為敏感種群朱砂葉螨。試驗按照各個螨態(tài)的具體發(fā)育歷期確定所選試驗對象。

1.2 供試藥劑及儀器

含5%辣椒堿類物質(zhì)的辣椒提取物(云南宏綠辣素有限公司)、Potter噴霧塔(BURKARD 公司)、酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)、PCR儀(Bio-Rad公司)、熒光定量PCR檢測儀(ABI公司)、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)、液氮、RNA提取試劑盒RNeasy Plus Micro Kit(QIAGEN公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time，TAKARA公司)、熒光定量檢測試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus，TAKARA公司)。

1.3 室內(nèi)毒力測定

采用葉碟噴霧法。在9 cm大小培養(yǎng)皿中放入吸水海綿保濕，海綿上平鋪濾紙，將實驗室栽培的無蟲豇豆葉剪成直徑5 cm大小的圓形葉蝶，葉背朝上平貼在濾紙上制成葉碟。Potter噴霧塔噴施藥劑，噴霧壓力為20 kPa，噴霧劑量為1 mL/葉碟[14]，藥后分別調(diào)查孵化率和死亡率，對照死亡率小于10%的實驗有效。

卵：初次準(zhǔn)備90個葉碟，每個葉碟上接入20～30頭雌成螨，產(chǎn)卵24 h后移除成螨。待卵發(fā)育至3日齡時，取其中21個葉碟噴施辣椒堿類物質(zhì)，濃度分別設(shè)置為6000、3000、1500、750、375、187.5 mg/L，每個濃度設(shè)3個葉碟作為重復(fù)。施藥后120、144 h調(diào)查卵孵化率。

幼螨、若螨：其余卵留在葉蝶上分別繼續(xù)孵化為黃白色3對足幼螨和4對足若螨(1日齡，含前期若螨和后期若螨)，噴施辣椒堿類物質(zhì)，濃度設(shè)置為500、250、125、62.5、31.25、15.625 mg/L，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，藥后24、48 h調(diào)查死亡率。

成螨：剩余若螨繼續(xù)發(fā)育為成螨(3日齡)，噴施辣椒堿類物質(zhì)，濃度設(shè)置為2500、1250、625、312.5、156.25、78.125 mg/L，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，藥后24、48 h調(diào)查死亡率。

1.4 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)的活性測定

1.4.1 朱砂葉螨各發(fā)育階段酶液制備 各發(fā)育螨態(tài)獲得方法同上。用LC30亞致死濃度的辣椒堿類物質(zhì)分別噴霧處理各發(fā)育階段螨，卵LC30濃度為1400 mg/L、幼螨和若螨LC30濃度為30 mg/L、雌成螨LC30濃度為400 mg/L，對照組用清水噴霧處理，對照組與處理組在噴霧處理后4、8、12、20、24 h時分別收集卵500粒、存活幼螨300頭、存活若螨200頭、存活雌成螨50頭，迅速置于-80 ℃冰箱保存，測定時加入緩沖液研磨，制成酶液。各取樣時間點分別設(shè)置3個重復(fù)樣品。

1.4.2 蛋白質(zhì)及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)比活力測定 使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，參照說明書測定并計算出朱砂葉螨各發(fā)育階段在各取樣時間點時的蛋白質(zhì)含量及酶比活力。

1.5 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)detal家族基因表達(dá)測定

將朱砂葉螨雌成螨用LC30亞致死濃度辣椒堿類物質(zhì)噴霧處理，對照組用清水噴霧處理后分別于4、8、12、20、24 h收集存活雌成螨150頭，迅速置于-80 ℃冰箱保存。每個取樣點取3個重復(fù)樣品。使用RNA提取試劑盒RNeasy Plus Micro Kit(QIAGEN公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time，TAKARA公司)、熒光定量檢測試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus，TAKARA公司) 參照說明書提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為CDNA保存于-20 ℃冰箱，用于檢測谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶detal家族基因表達(dá)量情況，RPS18作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

表1 朱砂葉螨谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶detal家族基因RT-qPCR引物

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用SPSS 17.0軟件的Probit模塊、獨立樣本T檢驗和Excel做數(shù)據(jù)分析，得出毒力回歸方程、LC30、LC50、LC90致死濃度值、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶比活力，計算酶活性抑制率等。

酶活性抑制率(%)=(對照組GSTs活性-處理組GSTs活性)/對照組GSTs活性×100

將基因相對表達(dá)量 Ct 值換算為相對表達(dá)量 2-△Ct值，其中,△Ct=目標(biāo)基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值。再利用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行獨立樣本T檢驗分析(P≤ 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒堿類物質(zhì)對敏感朱砂葉螨各發(fā)育階段的室內(nèi)毒力

由表2可知，辣椒堿類物質(zhì)對敏感朱砂葉螨卵、幼螨、若螨、成螨4個發(fā)育階段都表現(xiàn)出不同程度的殺螨活性并影響生長發(fā)育，且殺螨活性隨辣椒堿類物質(zhì)濃度升高而增強(qiáng)，殺螨效率從高至低排列為幼螨>若螨>成螨>卵。試驗中觀察到處理組的卵120 h后未孵化的，在144 h后也僅有少數(shù)能夠繼續(xù)孵化，并且藥劑處理后的卵即使是同時間孵化成幼螨，但后續(xù)生長發(fā)育明顯比對照組緩慢，且高濃度處理的卵在孵化為幼螨后大部分陸續(xù)死亡，不能正常發(fā)育到成螨。辣椒堿類物質(zhì)雖對各發(fā)育階段的朱砂葉螨都有一定的殺螨活性，但在卵期和成螨期施用劑量遠(yuǎn)高于幼、若螨期，施藥后 24 h幼螨LC50為51.50 mg/L；若螨為LC50為68.05 mg/L，由于辣椒堿類物質(zhì)有一定的辛辣刺激性氣味，使用高濃度進(jìn)行田間防控不便于人工操作，且對植物葉片有一定傷害，故選用低濃度的辣椒堿類物質(zhì)主要防控幼、若螨。

表2 辣椒堿類物質(zhì)對朱砂葉螨各發(fā)育階段的毒力

2.2 辣椒堿類物質(zhì)對敏感朱砂葉螨各發(fā)育階段谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性的影響

朱砂葉螨各發(fā)育階段GSTs活性變化如圖1所示，朱砂葉螨體內(nèi)GSTs活性由高到低排列為成螨>若螨>幼螨>卵。經(jīng)過LC30亞致死濃度辣椒堿類物質(zhì)處理，卵期(圖1-A)GSTs活性處理組與對照組變化趨勢相反，對照組 3、6、18、24 h GSTs比活力遠(yuǎn)高于處理組，分別為處理組的1.848、1.502、2.092、1.174倍，且3、6、18 h GSTs比活力與處理組存在極顯著差異(P<0.01)，說明LC30濃度辣椒堿類物質(zhì)對GSTs酶活性有抑制作用，抑制率分別為45.892%、33.442%、52.193%、14.803%；3～12 h處理組GSTs酶活性逐漸升高，12 h時達(dá)到最高值，之后又逐漸降低，說明辣椒堿類物質(zhì)雖然在一定程度上抑制了GSTs酶活性，但GSTs酶仍對外源物質(zhì)發(fā)揮著解毒代謝作用，12 h后解毒作用又顯著減弱。

如圖1-B所示，幼螨期處理組與對照組GSTs活性變化趨勢基本一致，4 h時處理組GSTs比活力遠(yuǎn)低于對照組，具有極顯著差異(P<0.01)，酶活性受到顯著抑制，抑制率為17.593%；8、12、20 h 時GSTs比活力高于對照組，分別是對照組的1.355、1.257、1.085倍，說明此時間段GSTs受到外源藥劑脅迫后酶活性被激活，且在8、20 h時處理組與對照組GSTs活性表現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)。

如圖1-C所示，若螨期在觀測時間段內(nèi)處理組GSTs比活力未出現(xiàn)明顯波動，趨于穩(wěn)定，說明若螨期GSTs酶對LC30亞致死濃度辣椒堿類物質(zhì)的敏感性較弱。

如圖1-D所示，成螨期，4、8、20、24 h時對照組GSTs比活力高于處理組，具有極顯著差異，分別是處理組的4.304、4.778、1.338、1.848倍，說明LC30亞致死濃度辣椒堿類物質(zhì)對成螨期GSTs酶活性有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率分別為76.768%、79.070%、25.235%、45.875%。從4 h到20 h期間處理組GSTs活性雖低于對照組但仍表現(xiàn)不斷升高趨勢，20 h達(dá)到最高值，隨后降低，說明成螨在接觸藥劑的20 h內(nèi)解毒作用不斷增強(qiáng)，之后減弱。

不同大寫字母表示同一時間2個處理差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示同一時間2個處理差異顯著(P<0.05)。下同Different capital letters indicate that the difference between the control and the drug treatment at the same time is extremely significant (P<0.01). Different lowercase indicates the difference between the control and the drug treatment at the same time is very significant (P<0.05). The same as below圖1 辣椒堿類物質(zhì)對敏感品系朱砂葉螨各發(fā)育階段谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響Fig.1 Effects of Capsaiciniods on the glutathione S-transferase activity for different developmental stages of sensitive Tetranychus cinnabarinus

2.3 辣椒堿類物質(zhì)對朱砂葉螨雌成螨谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)detal家族基因表達(dá)量的影響

由于雌成螨的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶酶活性遠(yuǎn)高于其余發(fā)育階段，故進(jìn)一步測定LC30亞致死濃度辣椒堿類物質(zhì)處理后的雌成螨GSTs中detal家族基因表達(dá)情況(圖2)。GSTs的detal家族包含16個基因，熒光定量檢測后在雌成螨中只有detal3、detal5、detal6、detal8、detal14這5個基因表達(dá)量相對較高，其余基因表達(dá)量極低，故進(jìn)一步分析這5個基因。

總體來看，LC30亞致死濃度辣椒堿類物質(zhì)處理后24 h內(nèi)，detal5基因平均表達(dá)量最高，約為detal3基因的26倍、detal6基因的13倍、detal8基因的5倍、detal14基因的2倍。藥劑脅迫處理后detal5基因的表達(dá)趨勢與對照組相反，4 ～12 h表達(dá)量持續(xù)下調(diào)，在12 h時達(dá)到最低，之后持續(xù)上調(diào)且極顯著高于對照組。detal3基因表達(dá)量處理組表現(xiàn)4～24 h持續(xù)上調(diào)，除12 h時外都高于對照組，但只有20 h時與對照組存在極顯著差異(P<0.01)。detal6、detal8基因在藥劑脅迫后處理組都表現(xiàn)為先下調(diào)后上調(diào)，4 ～12 h表達(dá)量變化趨勢與對照組一致，除12 h時外處理組表達(dá)量均高于對照組。detal14基因4～24 h表達(dá)量變化趨勢處理組與對照組一致，除12 h外，其余時間點表達(dá)量均高于對照組，且存在顯著性差異。由此推測，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶detal家族的這5個基因受辣椒堿類物質(zhì)脅迫后，除12 h時表達(dá)量低于對照組，其余時間點都被激活而表現(xiàn)為表達(dá)量增加，說明這5個基因可能在一定程度上參與機(jī)體解毒代謝的抗逆性應(yīng)激生理響應(yīng)。

圖2 辣椒堿類物質(zhì)對敏感品系朱砂葉螨雌成螨谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶detal基因的影響Fig.2 Effects of Capsaiciniods on the glutathione S-transferase detal gene activity for adult of sensitive Tetranychus cinnabarinus

3 討 論

由于內(nèi)稟性因素的影響，對照組各發(fā)育階段GSTs活性在24 h有變化，并非一直保持不變，處理組在接受LC30濃度辣椒堿類物質(zhì)脅迫后GSTs活性被激活或抑制，但變化趨勢也基本遵循內(nèi)稟性變化趨勢。侯曉琳、吳咚咚等[15-16]研究也表明，低劑量辣椒堿能誘導(dǎo)西花薊馬雌成蟲和煙粉虱體內(nèi) GSTs酶活性明顯升高，高劑量辣椒堿抑制 GSTs酶活性。試驗結(jié)果顯示LC30濃度辣椒堿類物質(zhì)對卵、成螨期GSTs有顯著抑制作用，尤其在成螨期GSTs對該外源藥劑的敏感性高于其余螨態(tài)，藥劑作用后8 h內(nèi)GSTs活性與對照組差異達(dá)4倍以上，酶活抑制率達(dá)75%以上；幼螨期活性顯著高于對照組，對若螨期抑制和激活作用不顯著，趨于穩(wěn)定，可推斷辣椒堿類物質(zhì)能夠抑制GSTs活性，從而抑制解毒作用，GSTs在受到外源物質(zhì)脅迫時也發(fā)揮一定的解毒作用，但解毒作用低于受抑制的程度。因為GSTs是個超基因家族，在朱砂葉螨中GSTs主要包括16條detal家族基因、12條Mu家族基因及一些與kappa家族相似度極高的基因，不同家族基因具有不同的調(diào)控功能，而GSTs是總酶的活性，它對外源物質(zhì)的響應(yīng)變化受內(nèi)稟性因素影響及各基因家族綜合作用，故detal家族基因表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)的趨勢與GSTs總酶活性變化不完全對應(yīng)，可進(jìn)一步測定其余家族的基因表達(dá)情況，綜合評定GSTs基因家族與酶活性變化的聯(lián)動響應(yīng)情況[17]。藥劑對于朱砂葉螨的殺螨機(jī)理也是綜合機(jī)制，外源藥劑脅迫后螨體內(nèi)羧酸酯酶(CarE)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、多功能氧化酶(MFO)、細(xì)胞色素P450等解毒代謝酶系都會發(fā)揮作用，GSTs酶的應(yīng)激響應(yīng)變化僅是一方面的作用。由于辣椒堿類物質(zhì)有一定的辛辣刺激性氣味，使用高濃度田間防控不便于人工操作，但可選用低濃度的辣椒堿類物質(zhì)防控幼、若螨，也可進(jìn)一步研究辣椒堿類物質(zhì)對其余解毒代謝酶的作用情況，確定其互作機(jī)理，篩選出能夠發(fā)揮最佳抑制作用的濃度，將辣椒堿作為植物源增效劑與適宜的農(nóng)藥搭配使用，降低化學(xué)農(nóng)藥的使用劑量，降低害螨、害蟲抗藥性，提高田間防效，或以辣椒堿類物質(zhì)為基礎(chǔ)原料開發(fā)新的生物農(nóng)藥。

4 結(jié) 論

朱砂葉螨卵的孵化率隨辣椒堿類物質(zhì)濃度升高而降低，且能孵化的螨也不能正常發(fā)育至成螨，低濃度辣椒堿類物質(zhì)對幼螨、若螨有較好的殺螨效果，成螨次之，殺螨機(jī)理主要是辣椒堿類物質(zhì)抑制了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性，使其對外源有毒有害物質(zhì)的解毒代謝作用減弱。在基因水平上，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶中detal3、detal5、detal6、detal8、detal14等基因在辣椒堿類物質(zhì)脅迫后被激活表達(dá)量高于對照組，呈現(xiàn)在一定程度上參與機(jī)體解毒代謝的抗逆性應(yīng)激生理響應(yīng)。