低磷脅迫對大花序桉幼苗葉片生理指標的影響

何榜眼，劉世男，楊 梅，梁喜獻，2

(1.廣西大學林學院，南寧 530004；2.廣西大學行健文理學院，南寧 530004)

【研究意義】磷作為植物生長必需的元素之一，不僅是植物體內生物膜、核酸及腺苷三磷酸(ATP)等多種物質的組成成分，還參與植物的呼吸作用、光合作用和信號傳導等代謝過程，對植物的生長發育具有重要作用[1-3]。已有研究表明，植物可利用的磷主要為土壤中的有效磷，當土壤有效磷不足時，植物在其生理生化方面會發生明顯變化，正常生長發育受到影響，但植物也會主動發揮自身的調節能力適應逆境，以增加其完成生命周期的機會[4-5]。大花序桉(EucalyptuscloezianaF.Muell)是我國南方重要的實木用材樹種[6]，被廣泛應用于建筑、工礦、家具及坑木等[7-8]。在我國南方地區，土壤膠體含有大量氫離子和鋁離子，土質黏重，通透性差，其有效磷嚴重缺乏[4，9]，所栽培的大花序桉苗木生長速度緩慢，容易出現植株矮小等不良現象。土壤缺磷已成為限制大花序桉產量的主要因素之一。因此，探究低磷脅迫對大花序桉幼苗葉片生理指標的影響，對大花序桉幼苗的抗低磷機制研究及推廣栽培具有重要意義。【前人研究進展】低磷脅迫下植物體內的保護酶活性、光合色素含量和葉綠素熒光參數等生理指標會發生相應的變化，可反映植物對低磷脅迫的抗性[10-11]。葉思誠[12]研究表明，低磷脅迫會對油茶(Camelliaoleifera)葉片造成損害，使其葉綠素含量、最大光化學量子效率(Fv/Fm)和實際光化學效率(ΦPSⅡ)下降，但油茶葉片會通過提升體內保護酶活性來保護其機體。高樂等[13]研究表明，低磷脅迫可提高橡膠(Heveabrasiliensis)葉片丙二醛(MDA)含量，引起葉片膜脂過氧化，而通過提升過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性可緩解橡膠葉片的膜脂過氧化，這是其對低磷脅迫的一種適應性反應。陳凱[14]研究也發現，山白蘭(Paramicheliabaillonii)葉片的MDA含量會隨著磷濃度的降低而增加，而通過提升SOD和過氧化物酶(POD)活性可減少低磷脅迫對其機體造成的傷害，但重度脅迫下其SOD活性會遭受抑制，表明山白蘭對低磷脅迫的適應性存在一定限度。袁繼存等[15]研究發現，當磷濃度低于1.0 mmol/L時，蘋果(MaluspumilaMill.)葉片的葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和類胡蘿卜素(Caro)含量顯著降低。王陽等[16]研究也發現，當磷肥施用量低于30 g/株時，核桃(JuglansregiaL.)各光合色素的含量顯著降低。袁繼存等[17]研究不同磷濃度水平對梨(Pyrusspp.)葉片生理的影響，發現梨葉片初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、可變熒光(Fv)及Chl a、Chl b和Caro含量在一定范圍內會隨著磷濃度的升高而增加，并在磷濃度為1.5 mmol/L時達到最大值，比缺磷處理(0 mmol/L)分別提高9.04%、9.49%、9.57%、42.7%、60.9%和37.8%，表明供磷不足時梨葉片光合作用受到顯著抑制。【本研究切入點】目前，國內外對大花序桉的研究主要圍繞遺傳選育[18-19]、組培快繁[20-21]、營林撫育[22]和木材性質[23]等展開，有關低磷脅迫對大花序桉葉片生理指標影響的研究鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】以大花序桉無性系1203號和1212號幼苗為試驗材料，測定低磷脅迫后其葉片的保護酶活性、光合色素含量和葉綠素熒光參數等指標，探究低磷脅迫對大花序桉葉片生理指標的影響，為大花序桉的抗低磷機制研究及其苗木的推廣種植提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試大花序桉為生產上常用的2個優良無性系1203號和1212號10個月苗齡組培苗。幼苗平均株高(30.0±3.2)cm，平均地徑(2.41±0.3)mm，生長健壯，無機械損傷和病蟲害。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 2019年11月6日，將從市場上購回的大花序桉幼苗統一用去離子水洗凈根際土壤，在廣西大學林學院苗圃溫室大棚中進行水培。以1/2 Hoagland營養液為組培苗提供營養，以KH2PO4作為處理磷源，參照Fanghua等[24]的方法設置2個磷濃度處理，分別為低磷(0.1 mmol/L)和正常磷(1.0 mmol/L)，并以KCl平衡不同處理中的K+濃度差異。采用完全隨機設計，每處理培養3盆(3個重復)，每盆培養10株，所有處理共培養120株。每3 d更換1次培養液，利用充氣泵24 h充氧，以保證大花序桉幼苗根系有良好的通氣狀況。培養至2019年11月27日，進行幼苗葉綠素熒光參數測定；次日7：00—9：00用剪刀剪取生長位置和成熟度一致的大花序桉幼苗鮮葉，洗凈后用冰袋保存，迅速帶回實驗室，進行其他指標測定。

1.2.2 測定指標及方法 保護酶活性及MDA含量測定：SOD活性采用氮藍四唑(NBT)法[25]測定，多酚氧化酶(PPO)活性采用鄰苯二酚法[26]測定，POD和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性分別用愈創木酚法和紫外吸收法測定[27]；MDA含量以硫代巴比妥酸法[28]進行測定。

光合色素含量測定：葉綠素和Caro含量參照熊慶娥[29]的方法進行測定，使用95%酒精避光浸提葉片24 h后，分別在665、649、470 nm波長下測定浸提液的吸光度，進而計算Chl a、Chl b和Caro含量。

葉綠素熒光參數測定：采用便攜式葉綠素熒光儀PAM-2500測定葉片PSⅡ初始熒光(Fo)和最大熒光(Fm)原始參數，再計算其他參數。測定Fo和Fm時，提前將大花序桉幼苗暗適應30 min。各葉綠素熒光參數計算公式：Fv=Fm-Fo；最大光化學效率(Fv/Fm)=(Fm-Fo)/Fm；實際光化學效率(ΦPSⅡ)=(Fm′-F)/Fm；非光化學淬滅系數(NPQ)=(Fm-Fm′)/Fm′。式中，Fm′為葉片未經過暗適應所測得的最大熒光，F為任意時間的實際熒光產量。

1.3 統計分析

采用Excel 2019進行數據統計和制圖，以SPSS 24.0進行單因素方差分析(ANOVA)，以Duncan’s新復極差法分析不同處理間的差異顯著性，以Pearson相關系數分析各指標間的相關性。

2 結果與分析

2.1 低磷脅迫對大花序桉幼苗葉片保護酶活性及MDA含量的影響

從圖1可看出，低磷處理大花序桉無性系1203號和1212號幼苗葉片的SOD活性分別為18.42和16.25 U/g FW，PPO活性分別為894.13和1138.00 U/g FW，POD活性分別為579.67和471.33 U/gFW，APX活性分別為1598.89和688.33 U/g FW，均顯著高于正常磷處理(P<0.05，下同)。其中，低磷處理無性系1203號幼苗葉片的SOD、PPO、POD和APX活性升幅分別為25.82%、22.73%、6.60%和8.64%，無性系1212號幼苗葉片的SOD、PPO、POD和APX活性升幅分別為57.16%、6.14%、42.43%和64.32%。說明低磷脅迫會引起大花序桉無性系幼苗葉片的保護酶活性顯著升高，其中無性系1212號幼苗葉片的SOD、PPO和APX活性升幅大于無性系1203號，而POD活性升幅小于無性系1203號。

同一小圖圖柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Different lowercase letters on the histogram indicated a significant difference(P<0.05)，the same as below圖1 大花序桉2個無性系幼苗葉片的各保護酶活性對比Fig.1 Comparison of protective enzyme activities in leaves of two clones of E. coleziana

從圖2可看出，低磷處理大花序桉無性系1203號和1212號幼苗葉片的MDA含量分別為0.0032和0.0037 μmol/g FW，均較正常磷處理顯著提高。其中，低磷處理無性系1203號幼苗葉片的MDA含量比正常磷處理提高21.89%，無性系1212號幼苗葉片的MDA含量比正常磷處理提高15.63%。說明低磷脅迫會引起大花序桉無性系幼苗葉片的MDA含量顯著提高，其中無性系1212號葉片MDA含量的提高幅度小于無性系1203號。

圖2 大花序桉2個無性系幼苗葉片的MDA含量對比Fig.2 Comparison of MDA content in leaves of two clones of E.coleziana

2.2 低磷脅迫對大花序桉幼苗葉片光合色素含量的影響

在低磷處理下，大花序桉無性系1203號和1212號幼苗葉片的Chl a含量分別為1.10和1.01mg/g，Chl b含量分別為0.55和0.50 mg/g，葉綠素總量分別為1.65和1.51 mg/g，Caro含量分別為0.17和0.12 mg/g，均較正常磷處理低(圖3)。其中，低磷處理無性系1203號幼苗葉片的Chl a、Chl b、葉綠素總量和Caro含量均較正常磷處理顯著下降，降幅分別為9.84%、15.38%、11.76%和26.09%，無性系1212號幼苗葉片的Chl a、Chl b和葉綠素總量較正常磷處理無顯著差異(P>0.05)，Caro含量下降顯著，降幅分別為5.61%、9.09%、5.16%和20.00%。說明在低磷脅迫下，2個大花序桉無性系幼苗葉片光合色素的合成均受到抑制，但無性系1212號受到抑制的程度較小。

圖3 大花序桉2個無性系幼苗葉片的各光合色素含量對比Fig.3 Comparison of photosynthetic pigment content in leaves of two clones of E.coleziana

2.3 低磷脅迫對大花序桉幼苗葉綠素熒光參數的影響

從表1可看出，相較正常磷處理，低磷處理下大花序桉2個無性系幼苗的Fo和NPQ均上升，Fm、Fv、Fv/Fm和ΦPSⅡ均明顯下降。其中，低磷處理無性系1203號幼苗的Fo和NPQ分別為0.082和1.44，較正常磷處理分別上升6.0%和71.43%，Fm、Fv、Fv/Fm和ΦPSⅡ分別為0.37、0.29、0.78和0.31，較正常磷處理分別下降17.78%、21.61%、6.02%和16.22%，但僅Fo的變化未達顯著水平；低磷處理無性系1212號苗木的Fo和NPQ分別為0.082和1.35，較正常磷處理分別上升4.8%和45.16%，Fm、Fv、Fv/Fm和ΦPSⅡ分別為0.40、0.31、0.79和0.32，較正常磷處理分別下降9.09%、13.89%、3.66%和11.11%，但僅NPQ的變化達顯著水平。說明低磷脅迫對2個無性系苗木葉片的光合機構均造成損傷，而NPQ上升說明其葉片光合機構對低磷脅迫作出了應對，以減輕其損傷程度。

表1 大花序桉2個無性系幼苗葉片各葉綠素熒光參數對比

2.4 磷濃度與大花序桉安幼苗葉片各生理指標及各生理指標之間的相關分析

由表2可看出，磷濃度與Fv、Fv/Fm和ΦPSⅡ呈顯著正相關，與Fo和NPQ呈顯著負相關；PPO活性與Chl a和Caro含量呈顯著負相關，與MDA含量高度正相關且與Chl a、Chl b及Caro含量高度負相關(|r|>0.8)；MDA含量與Chl a和Caro含量呈顯著負相關，與Chl b含量呈極顯著負相關(P<0.01，下同)；3種光合色素兩兩之間均呈顯著正相關；Fo與Fv和Fv/Fm呈顯著負相關，與ΦPSⅡ呈極顯著負相關，與NPQ呈極顯著正相關；Fm與Fv呈極顯著正相關，與Fv/Fm和ΦPSⅡ呈顯著正相關，與NPQ呈顯著負相關；Fv與Fv/Fm、ΦPSⅡ呈極顯著正相關，與NPQ呈極顯著負相關；Fv/Fm與ΦPSⅡ呈極顯著正相關，與NPQ呈極顯著負相關；ΦPSⅡ與NPQ呈極顯著負相關。總體而言，磷濃度與各保護酶活性、MDA和光合色素含量間存在一定的相關性，但均未達顯著水平，而與大部分葉綠素熒光參數間呈顯著相關，說明低磷脅迫對大花序桉苗木各生理指標存在不同程度的影響，其中，對葉綠素熒光參數的影響最大。

表2 磷濃度與大花序桉幼苗葉片各生理指標及各生理指標間的相關分析結果

3 討 論

在正常情況下，植物細胞內氧自由基的產生與清除處于動態平衡狀態，當遭受逆境時，這種平衡會被打破，造成氧自由基含量上升，對植物膜系統造成傷害[30]。MDA是植物細胞膜脂過氧化的產物之一，會嚴重損害生物膜，其含量的變化能在一定程度上反映植株的自我修復能力，因此常用于評價植物對逆境的反應能力[31]。本研究發現，低磷處理下兩個大花序桉幼苗無性系葉片的MDA含量均升高，表明低磷脅迫對大花序桉幼苗造成了損害。為了減輕傷害程度，其體內的保護酶系統被激活，葉片SOD、PPO、POD和APX活性明顯增強，因此，大花序桉幼苗能快速清除其體內增多的自由基，恢復原來的動態平衡，與杉木(Cunninghamialanceolata)和赤皮青岡(Cyclobalanopsisgilva)在低磷下的表現較一致[32-33]。

光合色素是植物將無機物轉變成有機物的關鍵介質，其含量的變化對植物光合作用具有很大影響，在一定程度上影響植株的正常生長和抗逆性[34]。喬光等[35]對馬尾松(Pinusmassoniana)、裘珍飛等[36]對黑木相思(Acaciamelanoxylon)研究發現，低磷脅迫可使總葉綠素含量下降，但對類胡蘿卜素含量的影響較小。本研究中，低磷處理會引起大花序桉苗木葉片的Chl a、Chl b和Caro含量下降，與喬光等[35]對馬尾松、裘珍飛等[36]對黑木相思的研究結果一致。說明低磷處理阻礙了大花序桉苗木光合色素的合成，推測可能與低磷處理下其光合組織受損有關。

植物體的葉綠素熒光參數對逆境十分敏感，可以提供植物耐脅迫性和光系統損害程度等有用信息[37]。NPQ是植物為防止光合機構受到損害所形成的一種自我保護機制[38]，當植物遭受嚴重脅迫時會明顯提升[39]。本研究中，供試的2個大花序桉無性系受低磷脅迫影響，Fo均上升，說明二者的PSⅡ反應中心已經受到損害；Fm、Fv、Fv/Fm和ΦPSⅡ下降，說明二者PSⅡ反應中心的電子傳遞、QA的氧化還原和光能轉換等均受到了阻礙；而NPQ均上升，說明大花序桉對低磷逆境作出了響應，以減少PSⅡ反應中心進一步損傷。

低磷脅迫下植物葉片各生理指標的變化存在一定的相關性，通過相關性分析可獲知其關聯程度。陳雯彬等[10]研究表明，低磷脅迫下赤皮青岡葉片MDA含量與POD和SOD活性呈極顯著正相關。陳健曉[40]等研究發現，水稻(OryzasativaL.)在低磷脅迫下葉片各葉綠素熒光參數間存在顯著相關關系。本研究中，大花序桉葉片6個葉綠素熒光參數均與磷濃度呈高度相關，其中僅Fm與磷濃度無顯著相關性，說明低磷脅迫易引起大花序桉葉片Fo、Fm、Fv、Fv/Fm和ΦPSⅡ異常，造成葉片PSⅡ反應中心損傷，而通過提升NPQ是大花序桉減少葉片損害的重要手段；MDA含量與Chl a、Chl b和Caro含量均呈顯著負相關，說明低磷脅迫引起MDA含量的積累對大花序桉葉片生物膜系統造成了不可逆的損傷，從而影響其葉片光合色素的合成；PPO活性與MDA含量高度正相關且與Chl a、Chl b及Caro含量高度負相關，說明在葉片光合組織受損時，PPO的敏感性極高，在大花序桉保護葉片光合組織的過程中發揮著極大作用。此外，6個葉綠素熒光參數中，除Fo與Fm的相關性未達顯著水平外，其余參數兩兩間均呈顯著相關，說明大花序桉苗木葉片光系統的各項功能存在密切聯系，在受到低磷脅迫時，其功能的完整性會受到明顯影響。因此，在生產實踐中可將葉片保護酶活性、光合色素含量和葉綠素熒光參數作為檢測大花序桉幼苗磷素營養狀況的指標，并注意適時對大花序桉幼苗施用磷肥。

4 結 論

低磷脅迫使大花序桉苗木葉片大量積累MDA，導致葉片組織受到不可逆損傷，進而引起葉片光合機構功能異常；但大花序桉苗木能通過對葉片SOD、PPO、POD和APX等保護酶和NPQ的綜合調節來減輕低磷脅迫引起的傷害，尤其以PPO和NPQ的調節作用更佳，二者在減輕大花序桉苗木葉片損害過程中可能發揮著重要作用。