雙歧桿菌制劑對大鼠腫瘤模型化療引起腸道炎癥的影響

潘 捷，段達榮

（臺州市第一人民醫院醫學門診部1，檢驗科2，浙江 臺州 318020）

化學藥物療法（chemotherapy）是腫瘤常用的治療方法之一，隨著該方法的廣泛使用和療效的提高，使得腫瘤患者的壽命大大延長；而化療藥物可誘發腸道黏膜的微炎癥，造成腸道屏障功能破壞、腸道通透性增加等改變，臨床上表現為惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等不良反應，進而腸道細菌穿過腸道屏障進入血流，引起嚴重的血流感染，從而影響到治療的進程，甚至危及患者生命[1-3]。有研究顯示[4，5]，化療期間補充雙歧桿菌可能減輕腸道黏膜微炎癥，雙歧桿菌所產生的短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）類物質可明顯減輕患者體內的結腸炎及化療誘導的腸道黏膜微炎癥反應，降低化療患者血流感染的發生率。本研究在對SD 大鼠腫瘤應用氟尿嘧啶治療過程中加入不同劑量的雙歧桿菌，觀察大鼠腸道炎癥指標的變化，以明確雙歧桿菌對減少氟尿嘧啶化療過程中發生血流感染的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇健康SD 大鼠24 只，重量160～180 g，由溫州醫科大學動物實驗中心提供，許可證號：SYLK（浙）2015-0008。實驗方案經實驗動物倫理委員會批準，實驗過程遵循了國際獸醫學編輯協會《關于動物倫理與福利的作者指南共識》和本地及國家法規。實驗動物在麻醉下進行所有的手術，并盡一切努力最大限度地減少其痛苦和死亡。

1.2 試劑與儀器 雙歧桿菌制劑采用酪酸梭菌雙歧桿菌二聯活菌（商品名：常樂康，山東科興生物制品有限公司，批號：S20190015，規格：500 mg/袋）；氟尿嘧啶主要作用成份為5-氟尿嘧啶（海南中化聯合制藥工業股份有限公司，批號：1904221，規格：0.5 g/支）；糞便隱血（OB）試劑盒（匹拉米酮半定量檢測法，中國珠海貝索生物技術有限公司，批號：B190402）；革蘭染色液（中國珠海貝索生物技術有限公司，批號：A190301）、腸組織髓過氧化物酶（MPO）（美國R&D公司，批號：19082101），促炎因子NF-κB（美國Santa Cruz 公司，批號：191106），H22 腫瘤細胞（購自中科院細胞研究所）；酶標儀（瑞士帝肯公司，型號：TECAN HB-150E）；顯微鏡（日本OLYMPUS 型號：CX31）。

1.3 動物腫瘤模型的建立及相關指標的檢測 取H22腫瘤細胞，3000 r/min 離心5 min，再用生理鹽水洗3次，并做適當稀釋。取40 μl 細胞懸液加入10 μl 0.4%溴酚藍染色并鏡檢計數，并制成3×106個/ml 腫瘤細胞懸液，分別給予SD 大鼠右腋皮下接種腫瘤細胞懸液0.2 ml。接種完成后，逐日進行觀察，如果出現腫瘤迅速增長，符合大鼠腫瘤模型。將符合大鼠腫瘤模型的大鼠分為A、B、C、D 4組，每組6 只。A組作為對照，B組給予氟尿嘧啶，C組給予氟尿嘧啶+低劑量雙歧桿菌，D組給予氟尿嘧啶+高劑量雙歧桿菌。氟尿嘧啶按10 mg/（kg·d）喂量，低劑量雙歧桿菌按10 mg/（kg·d）喂量，高劑量雙歧桿菌按50 mg/（kg·d）喂量，對照組不使用氟尿嘧啶或雙歧桿菌喂養。每日觀察大鼠的體重、活動、飲食情況及糞便隱血情況，并對糞便進行革蘭染色評估，判斷革蘭陽性菌及革蘭陰性菌。連續7 d 后對大鼠進行注射麻醉解剖，觀察腸道充血、水腫、潰瘍情況，檢測MPO、NF-κB 活性。

1.4 檢測指標及賦值 MPO、NF-κB的檢測方法參照試劑使用說明書進行，對腸組織進行冷凍切片，進行HE 染色，HE 染色過程參照相關操作規程進行，糞便革蘭染色過程參照相關操作規程進行，球菌與桿菌比值按比值計算。糞便隱血采用匹拉米酮半定量檢測法，判讀陰性、1+、2+、3+、4+，并分別賦值0、1、2、3、4。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料用（±s）表示，兩組間獨立樣本采用t檢驗，計數資料采用[n（%）]表示，行x2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠相關檢測指標情況 B、C、D組大鼠體重均小于A組，差異有統計學意義（P＜0.05），但D組大鼠體重高于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；B組糞便細菌染色的球桿比高于A組，D組糞便細菌染色的球桿比高于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）；A組糞便隱血、腸組織MPO 和NF-κB 低于B、C、D組，B組隱血、MPO 和NF-κB 低于C、D組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠相關檢測指標情況（±s）

表1 各組大鼠相關檢測指標情況（±s）

注：與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05

組別A組B組C組D組體重（g）178.61±5.03 160.14±6.78a 166.47±3.86a 169.52±3.83ab球桿比0.41±0.14 2.27±0.33a 2.21±0.49a 0.91±0.13abc隱血0.24±0.13 3.47±0.52a 1.26±1.48ab 1.12±1.04ab MPO 19.62±2.08 76.34±8.21a 76.18±8.13a 53.51±5.25abc NF-κB 1.49±0.90 8.94±1.52a 8.31±0.54a 5.24±0.69abc

2.2 各組大鼠腸組織HE 染色情況 對大鼠腸組織進行HE 染色發現，A組無明顯炎性細胞浸潤，基本正常結腸組織結構；B組腸組織的黏膜、黏膜下炎癥細胞重度浸潤；C組黏膜下層炎癥明顯細胞浸潤，腺體減少；D組黏膜下輕度炎癥細胞浸潤，見圖1。

圖1 各組大鼠腸組織HE 染色（×200）

3 討論

人體腸道上皮細胞內含有特殊的耐受性樹突狀細胞、巨噬細胞和調節性T 細胞，這些免疫細胞可以產生許多抗炎細胞因子，從而下調炎癥反應，維持腸道內環境的穩定[6，7]。腸道內正常菌群或其代謝產物可通過與腸上皮細胞表面的Toll 樣受體（toll-likereceptors，TLR）結合，啟動下游炎癥反應因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6 等），維持腸道內環境的穩定[8，9]。一些藥物（特別是化療藥物）的使用可改變這種穩定狀態，化療期間腸道黏膜微炎癥的發生與腸道菌群及其代謝產物的變化密切相關，腸道菌群可發生改變[10]，而這些改變的菌群會合成多種代謝產物，這些產物在腫瘤的發生和發展過程中發揮了作用，不利于腫瘤的治療。Konishi H 等[11]研究指出，腸道共生菌，特別是雙歧桿菌、梭狀桿菌等革蘭陰性益生菌能夠改變腫瘤微環境，明顯減輕患者體內的結腸炎及化療誘導的腸道黏膜微炎癥反應[12]。如果在化療過程中加入大量雙歧桿菌等益生菌，可以提高機體對于寡核苷酸介導的腫瘤治療和鉑類化療的療效，有效降低化療血流感染風險，提高治療成功率[13]。

氟尿嘧啶是目前臨床上應用最廣的抗嘧啶類藥物，對消化道癌及其他實體瘤有良好療效，在腫瘤治療中占有重要地位，是一種常見的腫瘤化療藥物。氟尿嘧啶主要通過酶將其轉化為5-氟脫氧尿嘧啶核苷酸，5-氟脫氧尿嘧啶核苷酸通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成[14]。此外，氟尿嘧啶的代謝物也可以以代謝物的形式摻入到RNA 和DNA 中，影響細胞功能，產生細胞毒性，但其對腫瘤細胞作用的同時也會對正常細胞產生影響[15]。

MPO 是中性粒細胞的重要組成部分，是炎癥和組織損傷的重要指標。研究發現[16，17]，實驗性動物和炎癥性腸炎的MPO 活性增加，提示腸道炎癥發生。本研究結果顯示，采用氟尿嘧啶治療大鼠腸道腫瘤過程中MPO 活性明顯增強，說明雙歧桿菌能有效緩解腫瘤化療過程中對腸道上皮細胞的炎性損傷；同時，增加雙歧桿菌制劑的劑量后MPO 活性降低，說明雙歧桿菌有助于減少腸道炎癥的發生。部分研究發現[18，19]，對有腸道腫瘤的實驗大鼠進行氟尿嘧啶單藥化療的過程當中，其腸道菌群的總數在化療期間明顯減低，特別是雙歧桿菌、梭狀桿菌集落Ⅳ及梭狀桿菌集落ⅪVa 等有益菌株的數量下降明顯。這種腸道微生態的改變更有利于致病菌的生長，增加化療誘導腹瀉等毒副反應的發生率，增加血流感染的風險。本研究顯示，化療會導致大鼠腸道菌群中球菌與桿菌比例倒置，影響菌群平衡，不利于腫瘤的治療，而加入雙歧桿菌會改善這一狀況，與報道結果基本一致[20，21]。促炎因子NF-κB 可以激活細胞因子、趨化因子等炎癥介質的表達[22]，參與結腸炎及其它腸道炎癥的表達。NF-κB的活性可反映炎癥的嚴重程度。研究發現[23，24]，使用化療藥對動物模型進行干預會導致NF-κB的活性加強，引起腸道炎性感染，最終導致治療失敗。本研究顯示，化療藥物治療后大鼠腸道NF-κB的活性大幅增加，但在加入大劑量的雙歧桿菌后NF-κB的活性降低；而從HE 染色的炎癥細胞浸潤程度也可以得出同樣的結果，進一步證實了雙歧桿菌的作用。

綜上所述，化療可以導致腸道內環境改變，誘導腸道炎性發生，導致治療的失敗。而在腫瘤化療過程中加入大劑量的雙歧桿菌制劑可以減少腸道炎癥和血流感染的風險，提高治療成功率。