PAX8與上皮性卵巢癌的關系研究

唐 帆，郭桂蘭

（1.青海大學研究生院，青海 西寧 810000；2.青海大學附屬醫院婦科，青海 西寧 810000）

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）在所有卵巢癌中大約占90%，其致死率在婦科腫瘤中居首位。EOC 按照組織類型主要可以分為漿液性癌、子宮內膜樣癌、透明細胞性癌和粘液性癌[1]，其中卵巢高級別漿液性癌（high-grade serous ovarian carcinoma，HGSC）占卵巢癌的80%，是EOC 中最致命的組織學亞型，也是惡性程度和致死率最高的婦科腫瘤[2]。目前，越來越多的組織學、分子和動物模型證據表明[3-5]，大多數EOC 病例來源于輸卵管上皮（fallopian tube epithelium，FTE）。配對盒基因8 抗原（paired box gene 8，PAX8）是目前卵巢癌中公認的可用于診斷的生物標志物，是EOC 中典型的譜系存活癌基因，其在HGSC 中表達，并與輸卵管上皮發育有關[6]。PAX8 通過限制基因轉錄在維持細胞功能上扮演重要角色，近年在基因靶向治療方面備受關注。因此，研究PAX8 有助于了解卵巢癌的起源部位和致癌特性，并有望為治療EOC 提供期望藥物靶標。本文主要就PAX8 與上皮性卵巢癌的關系進行綜述，以期為上皮性卵巢癌的臨床診斷、評估病情進展及預后、指導個體化治療提供參考。

1 PAX8的生物學特性

1.1 PAX8的結構與功能 PAX8 位于人染色體2q12-q14 上，是配對盒基因（paired boxgene，PAX）家族中的一員，該家族共有9 個基因，每個基因都編碼1 個含有配對盒DNA 結合結構域，和（或）1 個八肽域，和（或）1 個同源域的轉錄因子蛋白。這9 個基因根據結構可以分為4組：Ⅰ組（PAX1/PAX9）、Ⅱ組（PAX2/PAX5/PAX8）、Ⅲ組（PAX3/PAX7）和Ⅳ組（PAX4/PAX6）[7]。PAX 基因家族是胚胎組織發育和細胞分化的調節因子，起著促進細胞增殖、細胞譜系特異性維持、細胞遷移和細胞存活的作用。當發育完成后，PAX 基因的表達會減弱。但是在一些組織中PAX 基因的表達仍會持續到成年，或者其重新表達也是可能的。組成Ⅱ組（PAX2/PAX5/PAX8）的3 個基因在多種類型的癌癥中表達，因此有可能作為腫瘤標志物。

有學者用染色質免疫沉淀偶聯測序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）技術證明PAX8 傾向于結合內含子區域（82%）超過5’-UTR調節區域（2%），這表明PAX8 可能與調控基因表達的其他啟動子或非編碼RNA 結合[8]。此外，PAX8 結合轉錄因子CTCF 和轉錄因子SP1，兩者均參與染色質重塑。這些數據表明PAX8 既可以直接增加轉錄，也可以重塑染色質。另有研究表明[9]，PAX8 已顯示出直接結合并增加驅動HGSC的基因（如E2F1和p53）的轉錄，這說明PAX8 既可以作為規范轉錄因子，又可以作為表觀遺傳調節劑。

1.2 PAX8的作用

1.2.1 PAX8 對生長發育的作用 PAX8 在胎兒器官形成中具有重要作用[10]。在甲狀腺、苗勒管（苗勒管最終會發育形成輸卵管、子宮、子宮頸和陰道的上三分之一）和腎臟的器官形成中起著重要的作用，而且PAX8 在成年的甲狀腺和腎臟組織中仍然表達[11-14]。PAX8 是甲狀腺特異性基因甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，TG）、甲狀腺過氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO）和鈉/碘化物同向轉運蛋白基因（Solute carrier family 5 member 5，SLC5A5）表達所必需的[15]。研究發現，敲除小鼠的PAX8 基因后，小鼠甲狀腺較對照組小，且只有能分泌降血鈣素的濾泡旁C 細胞而沒有濾泡上皮細胞，因此不能產生甲狀腺激素，最終出現嚴重的甲狀腺功能減退癥。進一步的分子機制研究發現，PAX8 可以直接結合到甲狀腺特異性基因的啟動子區域，促進它們的轉錄表達。PAX8 敲除的小鼠在斷奶后會死亡，但如果持續補充甲狀腺素，小鼠仍能繼續存活6 個月，但有雌鼠會因沒有正常功能的子宮和陰道開口失去生育能力，且雌鼠會出現輸卵管積液和膨大[16]。研究認為，PAX8 屬于主要調節因子的轉錄因子，能夠調控包括甲狀腺特異性基因之外的其他基因。PAX8 主要在女性生殖系統內的異位子宮內膜細胞、子宮腺體細胞內彌散性分布，在分泌細胞中表達，在正常輸卵管與其傘端處的上皮細胞中呈現斑塊狀表達，在輸卵管型包涵體內表達[17]。

1.2.2 PAX8 促進細胞遷移 師凱旋[18]在4 種卵巢癌細胞系中（KURAMOCHI、HEY、SKOV3 和OVTOKO）利用CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9，Cas9）基因組編輯技術，用2 條獨立的單鏈導向RNA 來敲除PAX8 基因，發現PAX8 處于調節子網絡中的核心位置。同時，敲除PAX8 基因不僅抑制了細胞的增殖，而且抑制了細胞的遷移。為了排除細胞增殖和細胞運動之間的交叉影響，該研究進行了活細胞實時成像實驗，發現敲除PAX8的細胞隨機運動能力下降。另外，Paxillin 和F-actin的免疫熒光染色實驗證實了PAX8 敲除的細胞黏著斑增加。這些研究結果表明，PAX8 在功能上可以促進卵巢癌細胞的增殖及遷移，且PAX8-FGF18 信號通路以一種自分泌的方式促進腫瘤細胞的遷移。

1.2.3 PAX8 在各類腫瘤中的表達 子宮內膜癌、甲腺癌、卵巢癌、腎氣管癌等中均有PAX8 高表達[19]。在約36%的濾泡狀甲狀腺癌中，PAX8 會和氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）發生重排，成為1 個致癌的融合基因，仍然保留PAX8的DNA 結合結構域，調控細胞周期，促進細胞的增殖[20，21]。研究發現，隨著PAX8 表達的升高，患者罹患上皮性卵巢癌以及輸卵管上皮癌的概率會明顯增加。另外，PAX8 在89%的內膜樣卵巢癌、100%的透明細胞和96%的甲狀腺癌中均存在高表達，且與患者的預后密切相關[22]。有研究結果證實[23]，PAX8 參與了婦科惡性腫瘤的發生發展，以及介導了腫瘤的惡性生物學行為，尤其是在苗勒上皮來源惡性腫瘤中高表達，對FTE 源性的惡性腫瘤尤為明顯。

2 PAX8 與上皮性卵巢癌

2.1 PAX8 在上皮性卵巢癌中的機制及高表達PAX8 屬于核蛋白，為苗勒氏腫瘤標記物，具有良好的特異性與敏感性，且在卵巢癌內的表達存在高特異性與敏感性[24，25]，在判斷腫瘤細胞來源及鑒別細胞類型上有一定價值，可用于鑒別EOC。癌細胞系的全基因組RNA 干擾篩選是第一個確定PAX8 在卵巢癌中的重要性的方法。在卵巢癌細胞系和非卵巢癌細胞系之間的篩選中，PAX8 是排名最高的差異表達基因。敲低PAX8 可減少卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并增加細胞凋亡[26]。PAX8 可直接結合并增加p53的轉錄，然后增加p21 誘導增殖[27]。PAX8 還通過與RB 蛋白復合的E2f1 啟動子直接結合增加細胞周期調節因子E2f1的轉錄，從而促進腫瘤細胞的生長[28]。研究認為[29]，PAX8 病態的改變是導致輸卵管產生HGSC的基因表達變化的原因。在輸卵管和漿液性腫瘤細胞之間，PAX8 共有結合基序發生改變可能會影響下游調控的基因。

與正常的卵巢組織相比，PAX8 在EOC組織中呈高表達，而在卵巢上皮內包含囊腫的無纖毛上皮細胞和3 種上皮性卵巢癌亞型細胞（漿液、子宮內膜和透明細胞）中，PAX8 表達并且定位于細胞核中；此外，PAX8 在健康輸卵管粘膜的非纖毛的分泌細胞中表達，而在鄰近的纖毛上皮細胞中不表達[30]。有學者通過全基因組范圍內的RNA 干擾篩選來尋找不同類型癌細胞系的遺傳學敏感靶基因，進而在卵巢癌細胞系中發現了PAX8 對卵巢癌的增殖和存活起著至關重要的作用，并且在16%的原位卵巢腫瘤中出現拷貝數的增加，因此認為PAX8 是上皮性卵巢癌中1 個典型的譜系存活癌基因。關于PAX8 在上皮性卵巢癌中的表達尚存在爭議，有研究認為PAX8 未在上皮性卵巢癌中明顯表達，而有研究則認為其不僅在卵巢癌中呈陽性表達，還可作為上皮來源和盆腔間皮來源卵巢癌的重要鑒別標志[31，32]。不同的研究的差異可能是由于各個機構的病理標本選樣、手術方式、樣本含量等不同所致。鑒于PAX8是FTE 譜系特異性標記物，且大多數EOC 病例來自輸卵管上皮，因此可以認為PAX8 在EOC 中呈陽性表達。

2.2 PAX8 與上皮性卵巢癌預后的相關性 上皮性卵巢癌細胞的遷移與其預后密切相關。正常卵巢上皮（ovarian surface epithelium，OSE）最初被認為是卵巢癌祖細胞的位點，但是最新的證據表明正常FTE 是主要的祖細胞位點[33]。有研究使用蛋白質組學和轉錄組學分析PAX8 在人類卵巢癌模型以及OSE組織和FTE組織衍生的腫瘤模型中導致遷移能力增強的作用，發現PAX8 是遷移的主要調節劑，其獨特的下游轉錄靶標取決于細胞的起源部位[34]。HGSC中的PAX8 敲低可降低細胞增殖、遷移和侵襲，同時誘導細胞死亡[35]。卵巢癌細胞中PAX8 敲低后，腫瘤進展能力減弱[36]。需要說明的是，從健康的FTE 中敲除PAX8 幾乎沒有功能作用，也沒有顯著改變基因表達[37]。因此，在卵巢癌中抑制PAX8的表達能減少癌細胞的轉移，有利于卵巢癌的預后，因為卵巢腫瘤細胞依賴于PAX8，而正常FTE 不受PAX8 減少的影響。

2.3 PAX8 在上皮性卵巢癌治療中的作用 鑒于上述PAX8的功能和作用，可以考慮利用其特性來達到治療EOC的目的。唐海峰等[38]采用RNA 干擾技術分別處理HE4、PAX8 及HE4+PAX8 基因，結果發現，靶向沉默HE4 和PAX8 基因可增強卵巢癌細胞的化療敏感性。因此，靶向敲降PAX8 基因可協同化療抑制上皮性卵巢癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力并促進其凋亡，為上皮性卵巢癌的個體化精準治療提供了實驗依據。PAX8 和Yes 相關蛋白（YAP1）亦存在聯系，YAP1 是進化保守的Hippo 途徑的主要下游調節因子，可調節器官大小，細胞增殖和凋亡[37]。而PAX8 主要在非啟動子位點結合，并在超級增強子中富集，可以全局調節參與腫瘤發生的基因[36]。上述研究表明，PAX8 可以用于藥物開發，以減少腫瘤細胞的增殖、遷移和存活，同時不影響其他器官。

另外，實驗發現[39]，廣譜組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑能通過重塑表觀遺傳標記，破壞PAX8 轉錄及其下游基因表達，表明PAX8 是對HDAC 抑制劑超敏的基因之一。HDAC抑制和PAX8 消耗均可引起基因表達的整體變化，包括PAX8 調節劑。該試驗還組裝了一個患者衍生的異種移植隊列，其中包含來自七種不同類型實體癌的221 個模型，測序轉錄組分析表明，PAX8 在兩個EOC的異種移植中表達受限。建立了2 個卵巢異種移植模型，每個模型隨機分為4 個研究組，分別接受媒介物對照，順鉑，潘諾匹司他和組合療法。經過約4 周的治療，與單一藥物相比，順鉑+潘諾匹司他組合對腫瘤進展的抑制作用更為明顯，在EOC-002中實現了癌癥消退，在EOC-004 中實現了穩定的疾病。免疫組織化學染色顯示在潘諾匹司他存在下PAX8 表達減少，這與細胞增殖和存活不足有關。根據這些數據，研究人員建議化學療法與HDAC 抑制劑聯用可能是有價值的治療選擇，能使以PAX8 依賴性為特征的EOC 患者產生強大而持久的益處。更重要的是，有研究表明[34]，通過CRISPR 基因組改變或以膠束包裹的硫鏈絲菌肽進行藥物治療，靶向PAX8 可降低腫瘤負擔。這些發現表明，PAX8 是卵巢腫瘤中一種統一的蛋白驅動轉移，可作為治療從FTE 和OSE 衍生的HGSC的有效藥物靶標。由于PAX8 在發展中的甲狀腺中起著至關重要的作用，但PAX8 缺失對成年甲狀腺的影響仍然未知。幸運的是，有FDA 批準的用于甲狀腺機能減退的激素替代療法，可以減輕PAX8 目標療法對甲狀腺上皮細胞的脫靶作用。

3 總結

由于PAX8 在卵巢癌細胞的遷移、侵襲和致瘤中的發揮重要作用，卵巢癌細胞系中PAX8的丟失在體內和體外降低了腫瘤表型，并促進了細胞凋亡，因此，人們越來越有興趣評估PAX8，不僅將其作為診斷性生物標志物，而且還將其作為EOC的潛在治療靶標。在HGSC 中為新型癌癥治療確定藥物靶標一直是一項挑戰，因為它是一種異質性疾病，幾乎沒有共同的突變。PAX 蛋白很有前景，因為PAX8 在漿液性腫瘤中普遍表達。靶向PAX8 蛋白質可能在減少大多數患者的腫瘤生長和進展以及顯著提高患者生存率方面有希望。當務之急是進一步探索PAX8 在改變卵巢癌細胞與其腫瘤微環境相互作用中的特殊功能，因為該轉錄因子可能具有多種機制，這對于改善當前的治療方案可能至關重要。