齒齦內阿米巴接種對大鼠牙周炎發生發展的影響觀察

吳澤鈺，王琛，侯秋蓮

1 新疆醫科大學基礎醫學院，烏魯木齊830054；2 新疆醫科大學第一附屬醫院（附屬口腔醫院）牙體牙髓病科

牙周炎影響著世界上一半的成年人，表現為牙齒支持器官（包括牙周韌帶和牙槽骨）的漸進性破壞，可導致牙齒脫落，并與糖尿病、心血管疾病等全身性疾病相關。牙周炎的特征是微生物動態平衡的破壞，表明口腔黏膜微生物群落與宿主上皮細胞和免疫細胞之間復雜的相互作用網絡失衡［1］。齒齦內阿米巴（Entamoeba gingivalis，E. g）是已知在人類口腔中定居的內阿米巴，常常在健康的個體中被檢測到。雖然E. g被認為是一種危害較小的微生物，但關于它的致病性仍存在爭議，有研究［2］認為其與牙周病也有關聯。許多關于E. g的生物學和遺傳學特征的研究［3-4］提示，E. g在牙周病的初始階段和進展中起促進作用。近期的研究［5］提示，E. g在牙周炎發生發展中的作用有可能被忽略，E. g在健康口腔黏膜中的定植率為15%，這種定植可以是無癥狀的，并且被認為是非致病性的，但E. g也可通過巨噬細胞增多癥殺死活的上皮細胞，顯示出很強的致病性，它還能夠侵入撕裂的口腔黏膜，攝取活細胞的碎片，這表明它具有致病潛力。一項元基因組分析［6］表明，活性微生物群落的類組成多樣性降低是口腔炎癥部位的特征之一，而與此同時E. g卻在發生炎癥的牙周袋中的發現率顯著增加。研究［7-8］表明，免疫抑制劑醋酸潑尼松龍干預的情況下，可實現E. g的口腔內接種，并可導致牙周炎。2021 年1 月—5 月，本研究觀察了E. g接種對大鼠牙周炎發生發展的影響，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1. 1E. g蟲株、大鼠 選擇2021 年1 月—2 月就診于新疆醫科大學第一附屬醫院（附屬口腔醫院）牙周科并確診為牙周炎的成人患者，用已滅菌的牙周探針采集患者牙周袋內菌斑，將菌斑置于生理鹽水中，直接涂片，鏡檢觀察。發現有E. g者再次取牙周袋內容物，在28 ℃溫箱內放置于改良的含有青霉素（500 U/mL）和鏈霉素（500 U/mL）的蛋白胨-酵母-葡萄糖（Peptone-yeast-glucose，PYG）培養液中，無菌純培養4 d 至對數生長期，血細胞計數板計數原蟲，調制成原蟲濃度為3×104個/mL的懸液，振蕩混勻備用。6～8 周齡雄性SD 大鼠24 只，由新疆醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（新）2018-0002，分籠飼養，自由進食、水，飼料為動物實驗中心提供的標準大鼠飼養飼料。

1. 2 大鼠分組、牙周炎模型制備和E. g接種方法采用隨機數表法將24 只大鼠隨機分為對照組（C組）、齒齦內阿米巴干預組（E. g組）、實驗性牙周炎組（EP組）、混合干預組（mix組），每組6只。EP組采用4-0 絲線結扎左側上頜第一磨牙制作牙周炎模型，將結扎日期定為第0 天。C 組從第1 天開始，給予大鼠醋酸潑尼松龍1. 2 mg 肌注，共7 d；同時生理鹽水0. 2 mL涂抹于大鼠左上第一磨牙齦緣，共14 d。E. g組從第1 天開始，給予大鼠醋酸潑尼松龍1. 2 mg 肌注，共7 d；同時E. g懸液0. 2 mL 涂抹于大鼠左上第一磨牙齦緣進行E. g接種，共14 d。mix組第0 天采用4-0 絲線結扎左上第一磨牙制作牙周炎模型；第1天開始，給予大鼠醋酸潑尼松龍1. 2 mg肌注，共7 d；同時E. g懸液0. 2 mL 涂抹于大鼠左上第一磨牙齦緣進行E. g接種，共14 d。

1. 3 各組大鼠體質量及左上頜第一磨牙的牙周袋探診深度（PD）、齦溝出血指數（SBI）檢測 從實驗第1天開始至第14天，每日稱量大鼠體質量，然后用牙周探針輕探入左上頜第一磨牙齦溝內或袋內，測量PD，取出探針30 s 后，觀察有無牙齦出血及其出血量，記錄SBI。

1. 4 各組大鼠左上頜第一磨牙牙槽骨吸收情況觀察 實驗第15 天，所有大鼠腹主動脈取血處死大鼠，獲取左側上頜骨標本，使用SCANCO Medical AG進行microCT 檢查，觀察各組大鼠左上頜第一磨牙牙槽骨吸收情況。

1. 5 各組大鼠左上頜第一磨牙牙周組織病理學變化觀察 取各組大鼠包含牙周組織的左側上頜骨標本，4%多聚甲醛固定24 h，沖洗后EDTA脫鈣液脫鈣、沖洗后再次4%多聚甲醛固定4 h，沖洗后常規脫水，石蠟包埋，5 μm切片，按照HE染色試劑盒使用說明書要求對切片進行染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察大鼠左上頜第一磨牙牙周組織病理學變化。

1. 6 各組大鼠血清中環氧合酶2（COX2）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、白細胞介素6（IL-6）、血管內皮生長因子（VEGF）檢測 取各組大鼠腹主動脈血，凝血后在4 ℃條件下1 500 r/min 離心15 min，獲取上層血清，按照ELISA 檢測試劑盒說明書要求進行操作，檢測大鼠血清中COX2、MMP9、IL-6、VEGF。

1. 7 統計學方法 采用SPSS20. 0 統計軟件。計量資料呈正態分布時以-x±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0. 05 為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 各組大鼠體質量及左上頜第一磨牙的PD、SBI變化情況 各組大鼠體質量變化情況見圖1。由圖1 可見，C 組和E. g組大鼠體質量穩步增長，而EP 組與mix 組大鼠體質量均在實驗后期有較明顯的增長。各組大鼠左上頜第一磨牙的PD 變化情況見圖2。由圖2 可見，EP 組與mix 組PD 在第10～12 天左右達到高峰并趨于穩定，E. g組PD 于第6 天便達到高峰，并且數值明顯小于EP 組與mix 組；另外在實驗過程中，觀察到E. g組在實驗的第5～7 天牙齦腫脹明顯，齦緣平面高于正常齦緣；C 組大鼠牙齦緊貼牙齒，無法測量PD。各組大鼠結扎牙的SBI 變化情況見圖3。由圖3 可見，E. g組、EP 組與mix 組大鼠左上頜第一磨牙的SBI 在前7 d 均有不斷增加，后趨于穩定，并有所緩解，但EP 組與mix 組牙齦出血情況明顯重于E. g組，在第14 天時，mix 組SBI 明顯高于EP 組與E. g組；C 組在實驗過程中牙齦緊實，SBI為0。

2. 2 各組大鼠左上頜第一磨牙牙槽骨吸收情況比較 各組大鼠左上頜第一磨牙的microCT 檢查結果見圖4。由圖4 可見，C 組大鼠左上頜第一磨牙牙槽骨無吸收，牙周膜無增寬，EP 組、E. g組和mix 組牙周膜增寬明顯，并且EP 組、mix 組均可見牙槽骨吸收，mix組較EP組牙槽骨吸收更嚴重。

圖4 各組大鼠左上頜第一磨牙的microCT檢查結果

2. 3 各組大鼠左上頜第一磨牙牙周組織病理學變化比較 各組大鼠左上頜第一磨牙牙周組織病理學檢查結果見圖5。由圖5 可見，C 組大鼠牙齦上皮、齦溝上皮和結合上皮完整存在，上皮釘突無異常，膠原纖維排列正常且整齊，亦無炎癥浸潤；E. g組大鼠可見齦溝內有明顯炎癥浸潤，有牙周袋存在，但齦溝組織較完整，而EP組與mix組大鼠牙周組織可見大面積炎癥浸潤，齦溝內結扎痕跡明顯，有深牙周袋存在，膠原纖維排列紊亂，齦溝內上皮失去原有的形態。

2. 4 各組大鼠血清中COX2、MMP9、IL-6、VEGF 表達水平比較 各組大鼠血清中COX2、MMP9、IL-6、VEGF 表達水平比較見表1。由表1 可知，與C 組相比，E. g組大鼠血清中MMP9、IL-6、VEGF 表達水平顯著升高（P均＜0. 05），EP 組、mix 組大鼠血清中COX2、MMP9、IL-6、VEGF 表達水平均顯著升高（P均＜0. 05）；與E. g組相比，EP 組、mix 組大鼠血清中COX2 表達水平均顯著升高（P均＜0. 05）；與EP 組相比，mix 組大鼠血清中IL-6 表達水平顯著升高（P＜0. 05）。

表1 各組大鼠血清中COX2、MMP9、IL-6、VEGF表達水平比較（-x±s）

3 討論

牙周炎的特征是牙齒支持器官（包括牙周韌帶和牙槽骨）的漸進性破壞，導致不可逆的附著和牙槽骨喪失，是成年人牙齒脫落的主要原因，并與心血管疾病、糖尿病、癌癥和慢性呼吸道疾病之間相互關系。在全球范圍內，這種疾病的患病率約為11%，所以牙周炎的防治也需要我們進行多方面、多角度的研究。有研究［9-10］表明，E. g在老年患者及大學生人群中感染率均較高，口腔疾病的發生發展可能與E.g的感染存在相關性。流行病學調查顯示，HBV 感染的牙周病患者中，E. g的感染率較高，其牙周炎的嚴重程度也高于未感染HBV 的患者［11］。阿米巴在牙髓感染中的發病率很高，并可能通過富集抗吞噬細菌而促進其毒力增強［12］。多項研究［13］顯示，在廣泛的重度牙周炎的牙周袋中，E. g的存在率幾乎為100%，并通過大量上調炎癥細胞因子從而導致中性粒細胞浸潤。

本 研 究 中microCT 結 果 顯 示，EP 組、E. g組和mix 組牙周膜增寬明顯，另外在實驗過程中，觀察到E. g組在實驗的第5～7 天牙齦腫脹明顯，齦緣平面高于正常齦緣，并且EP組、mix組均可見牙槽骨吸收，mix組較EP組牙槽骨吸收更嚴重。在本研究中，與EP 組相比，mix 組大鼠血清中IL-6 表達水平顯著升高，但EP組、mix組與E. g組間的差異無統計學意義，這可能是E. g存在于大鼠口腔，上調牙周炎大鼠的IL-6，作為在牙周炎急性期高表達的細胞因子，導致口腔組織持續破壞的原因。中性粒細胞在保護宿主免受微生物入侵時，可以產生包括促炎細胞因子、基質金屬蛋白酶和活性氧物種上調在內的反應，所有這些都會導致與牙周炎相關的組織損傷和牙齒脫落［14］。在本研究中，EP 組、mix 組、E. g組大鼠血清中MMP9 和VEGF 的表達水平無統計學差異，但都較C 組升高，這也是導致大鼠牙周炎口腔黏膜被破壞的原因。E. g可能在牙周炎的發展中起間接作用。阿米巴有細胞質內的細菌，這些細菌可以在大的食物液泡內存活或死亡［15］。體外研究［16］表明，一種在口腔中發現的原生動物牙齦卟啉單胞菌，能夠進入、存活和復制卡氏棘阿米巴。這些結果表明，阿米巴可能是這些細菌的儲存庫，保護它們免受免疫細胞和阿莫西林等抗菌藥物的侵襲，并參與非手術治療后牙周袋的重新定植［17］。所以口腔內原生動物的存在，對于牙周炎的影響應重新評估。

本研究中，為了解E. g是否能夠侵入口腔黏膜，對各組大鼠牙周組織還進行了病理學檢查，結果顯示，E. g組可見齦溝內有明顯炎癥浸潤，有牙周袋存在，但齦溝組織較完整，而EP 組與mix 組大鼠牙周組織可見大面積炎癥浸潤，齦溝內結扎痕跡明顯，有深牙周袋存在，膠原纖維排列紊亂，齦溝內上皮失去原有的形態。BAO 等［18］對嚴重的全身性慢性牙周炎患者的炎癥牙齦進行了顯微鏡分析，組織染色后觀察到，在被大量中性粒細胞包圍的不同組織層中觀察到E. g，并通過聚合酶鏈式反應證實了E. g的存在，在未發炎的體外活組織標本的牙齦上皮內，顯微鏡分析沒有發現E. g；然而，在用手術刀輕微切開牙齦上皮層或用無菌針刺穿牙齦活組織后，發現阿米巴滋養體在孵育6 h后進入活躍期和攝食期，顯微鏡顯示阿米巴在牙齦組織內移動，穿透到活的宿主牙齦上皮細胞的細胞質中，并攝取宿主細胞核中的碎片，而在未損傷的牙齦中，孵育6 h 后未見阿米巴侵入。RAFAEL 等［19］分別于誘導SD 大鼠實驗性牙周炎后的第1、3、5、7、14、21 天處死動物，實驗得出結論，結扎誘導的大鼠實驗性牙周炎模型表現為兩個不同階段的進行性牙槽骨吸收：急性期（第1～14天）以炎癥和快速骨吸收為特征；慢性期（第14～21天）骨丟失無明顯進展。這些與本研究的結果相似，E. g組大鼠無論從臨床指標，或是血清中COX-2 水平均低于EP組及mix組。

目前，機械刮治及潔治是治療牙周炎的主要手段，使用硝基咪唑類抗菌藥物如甲硝唑，是機械治療的輔助手段。使用甲硝唑治療原蟲口腔感染時，成人常規推薦劑量為每天3 次，每次400 mg，為期1周，當患者存在免疫缺陷或合并有其他部位感染等情況時，藥量和用藥時間應適當增加。MOROZ等［20］通過體外實驗驗證，在14 種漱口液中，洗必泰在清除原蟲方面也有高效作用。

綜上所述，E. g接種可促進大鼠牙周炎的發生發展，表現為牙齦腫脹、牙槽骨吸收、牙齦炎癥浸潤等癥狀，且血清中COX2、IL-6等表達水平升高，表明它具有一定的致病潛力，提示在治療牙周炎的過程中應考慮E. g在口腔的感染情況。本研究提示E. g在口腔感染性疾病中的作用可能被低估，為牙周炎的預防及治療提供了新的思路。