生酮飲食對裸鼠人結腸癌皮下瘤生長的影響

王楷，黃思輝，吳騰飛，肖敏，邱振雄(通信作者)

深圳市寶安區中心醫院普外科 (廣東深圳 518000)

1 材料與方法

1.1 實驗動物

10只雄性5周齡SPF裸鼠，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2016-0002。

1.2 主要試劑及儀器

生酮飼料(江蘇美迪森生物醫藥有限公司)，HCT116結腸癌細胞(納生物技術有限公司)，TUNEL檢測試劑盒(南通碧云天生物技術有限公司)，RNA提取試劑盒(北京康為世紀生物技術有限公司)，逆轉錄試劑盒(諾唯贊生物技術有限公司)；CFX ConnectTM實時熒光PCR儀[伯樂生命醫學產品(上海)有限公司]，MF53倒置熒光顯微鏡(廣州市明美光電有限公司)，BQ-318D切片機(伯納生物技術有限公司)。

1.3 裸鼠成瘤及藥物處理

對10只雄性SPF裸鼠予以皮下接種HCT116結腸癌細胞(濃度為5×106個/ml，0.2 ml/只)，在瘤體為5 mm后，根據瘤體大小將裸鼠隨機分為正常飲食組(對照組)及KD飲食組(KD組)，每組5只，成瘤前兩組均自由進食，成瘤5 mm開始對照組自由進食標準飼料，KD組進食相等能量的生酮飼料，期間隔天記錄1次兩組的體質量變化，于飲食30 d后，處死兩組并測量瘤體組織的大小。

1.4 TUNEL染色

將瘤體組織切片放入65 °C烤箱中烤2 h，然后放置在二甲苯中進行脫蠟，隨后將切片依次放入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇和純化水中各5 min，再將切片移入濕盒中，在每個樣本上滴加50 μg/ml Proteinase K工作液，于37 ℃下反應30 min進行修復，然后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)充分洗滌3次，5 min/次，用吸水紙吸掉組織周圍的PBS；在每張玻片上滴加足夠量的脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL)檢測液，于37 °C下避光孵育1 h，然后再用PBS洗滌3次，5 min/次，用吸水紙吸干玻片上的液體，用抗熒光淬滅封片后于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 實時熒光PCR

按照RNA提取試劑盒說明書進行RNA提取操作，所有實驗用具均經0.1%焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水浸泡并經高壓滅活，然后進行RNA含量測定，即取RNA樣品并加入99 μl DEPC處理水，用紫外分光光度計測260、280 nm光密度(optical density，OD)值，計算OD260/OD280比值，若此值在1.8～2.0之間，則認為制備的RNA較純，隨后使用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄為cDNA反應；設計基因特異性引物，釆用20 μl反應體系，盡量在避光條件下加入所需成分，充分混勻，并使所有試劑沉積于管底，隨后應用CFX ConnectTM實時熒光PCR儀進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增及檢測。引物由通用生物系統(安徽)有限公司合成，序列見表1。

表1 引物名稱及序列

1.6 Western Blot免疫印跡法檢測

將瘤體組織研磨成漿后，加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液于冰上裂解30 min，期間每隔5 min劇烈震蕩30 s，共震蕩150 s，然后經高速離心機以12 000 r/min離心10 min，收集上清液到EP管中，于-80 ℃冰箱內保存備用；采用BCA檢測試劑盒(Bicinchoninic acid Protein Assay Kit)測定蛋白濃度并定量，隨后將蛋白與上樣緩沖液以1︰3的比例混勻，并煮沸變性；配制好5%濃縮膠、10%分離膠，加入電泳緩沖液，拔出梳子，從左至右依次加入各組別的30 μg蛋白樣品，以60 V、300 mA電泳至樣品到分離膠，后改為以120 V、200 mA電泳至溴芬蘭到分離膠最下沿；取出分離膠，并按照海綿墊—三層濾紙—膠—聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF膜)—三層濾紙—海綿墊的順序夾好濕法轉膜1 h；以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，分別加入B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和Bcl-2相關X(Bcl-2-associated X，Bax)蛋白抗體(1︰1 000)和GAPDH抗體(1︰1 000)，在4 ℃冰箱內孵育過夜后，經三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽+吐溫(Tris-HCl+Tween，TBST)緩沖液漂洗3次，分別加入山羊抗兔或鼠IgG二抗(1︰5 000)，室溫孵育1 h，再次經TBST緩沖液漂洗3次，于暗室中，在膜上滴加增強化學發光液(enhanced chemiluminescence，ECL)顯影。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 KD對裸鼠結腸癌皮下成瘤的影響

KD組的瘤體重量稍高于對照組，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

注：*表示與對照組比較，P>0.05圖1 KD對裸鼠結腸癌皮下成瘤的影響

2.2 KD對裸鼠結腸癌皮下成瘤細胞凋亡的影響

TUNEL染色結果顯示，KD組細胞凋亡率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 KD對裸鼠結腸癌皮下瘤組織中Caspase3和Caspase9 mRNA及Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

實時熒光PCR結果顯示，KD組Caspase3和Caspase9 mRNA表達水平高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖3。Western Blot結果顯示，KD組Bax蛋白表達水平高于對照組，Bcl-2蛋白表達水平低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

注：*表示與對照組比較，P<0.05；DAPI為4',6-二脒基-2-苯基吲哚，Apoptosis為細胞凋亡，Merge為融合圖2 TUNEL染色檢測KD對裸鼠結腸癌皮下成瘤細胞凋亡的影響

注：*表示與對照組比較，P<0.05；Caspase為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶圖3 兩組瘤體組織中Caspase3和Caspase9 mRNA表達水平的測定

注：*表示與對照組比較，P<0.05；GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，Bcl-2為B淋巴細胞瘤-2，Bax為Bcl-2相關X圖4 兩組瘤體組織中Bax和Bcl-2蛋白表達水平的測定

3 討論

本研究將人結腸癌HCT116細胞接種到雄性裸鼠皮下，制備裸鼠結腸癌移植瘤模型，并對裸鼠予以KD干預，結果顯示，干預后，KD組的瘤體重量雖高于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)，表明KD干預可延緩結腸癌瘤體的生長，與Hao等[9]的研究結果相似。進一步的TUNEL染色結果表明，KD可促進瘤體凋亡，且有研究發現，KD過程中的中間代謝產物β-羥丁酸可抑制HT29、Caco-2結腸癌細胞及C57BL-6小鼠的mTOR信號通路，并上調腸細胞中腸特異性轉錄因子表達，繼而維持小鼠的腸道穩態[16-17]，由此表明，KD干預可延緩結腸癌細胞皮下移植瘤瘤體生長并誘導瘤體凋亡，改善瘤體病理變化。Bcl-2、Bax為Bcl-2細胞凋亡家族的成員，兩者相互作用，將信號傳代給Caspase家族并誘導級聯放大，使細胞凋亡，因此，通過調控上述蛋白的表達，可影響腫瘤細胞的存活。本研究結果亦證實了KD可通過調控Caspase3和Caspase9 mRNA及Bax和Bcl-2蛋白表達，繼而促進結腸癌瘤體凋亡。

綜上所述，KD可抑制裸鼠結腸癌移植瘤生長，其是通過提高Caspase3和Caspase9 mRNA及Bax蛋白表達水平、降低Bcl-2蛋白表達水平實現的。