肺腺癌患者血清長鏈非編碼RNA miR155HG表達及意義

李博文，張心宇，劉 洋，劉 禹

(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院檢驗科，黑龍江 哈爾濱 150001)

非小細胞肺癌(Non-small-cell lung carcinoma,NSCLC)是嚴重威脅人類健康的腫瘤之一，據估計，全世界近四分之一的癌癥相關死亡病例由肺癌引起[1],而NSCLC又占肺癌的近85%。肺腺癌(Adenocarcinoma of lung,LUAD)是NSCLC最常見的組織學亞型。LUAD診斷時多為晚期或已發生轉移，往往錯過了最佳治療時間，盡管目前對腫瘤的治療取得了長足的進展，LUAD的5年生存率仍只有15%左右[2-4]。因此，找到一種能夠早期診斷LUAD的生物標志物十分必要。

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)是非編碼RNA(non-coding RNA)家族中的重要一員。LncRNA是一種長度超過200個核苷酸的RNA分子，不能翻譯成蛋白質。LncRNA miR155 Host Gene(LncRNA miR155HG)，又稱B細胞整合簇，位于染色體21q21上。有文獻報道，LncRNA miR155HG在彌漫性大B細胞瘤和原發性縱膈淋巴瘤中高表達[5]。LncRNA miR155HG促進膠質瘤和GBM腫瘤的生長，并與大腸癌、胰腺癌、喉鱗癌相關[6-8]。這些結果表明LncRNA miR155HG在腫瘤的發展、侵襲和轉移中起重要作用。血清和血漿中的循環RNA是目前分子標記物研究領域的熱點，在對疾病的臨床篩查和監測中有重要應用。LncRNA在血液、尿液等體液樣本中的表達穩定且具有組織特異性，因此我們認為血清中LncRNA miR155HG可能成為具有早期監測腫瘤發生價值的分子標志物。

LncRNA miR155HG在LUAD的發生過程中的表達水平與LUAD臨床特征的相關性尚不明確。本研究利用LUAD患者的血清標本及健康對照組血清標本，LncRNA miR155HG的表達水平利用實時熒光定量PCR(Quantitative realtime PCR,RT-qPCR)方法檢測，旨在明確LncRNA miR155HG在LUAD患者的血清中的表達差異性，探討其表達水平與LUAD臨床特征的相關性，評價其作為LUAD生物標志物的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月至2016年1月在哈爾濱醫科大學附屬第四醫院呼吸科住院的NSCLC患者為研究對象。本實驗共納入LUAD患者38例,男24例，女14例，年齡54～70歲，平均(62.7±8.2)歲。健康對照組25例，男16例，女9例，年齡52～68歲，平均(60.3±7.9)歲。入選患者的臨床診斷通過CT引導下經皮穿刺活檢或手術切除獲得組織標本進行的。病理學檢查完成。組織學分類根據WHO 2010版標準。入選病例排除其他腫瘤、變態反應性疾病、感染性疾病等影響。兩組一般資料比較無統計學差異(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫學倫理委員會審核后進行。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器與試劑：Tizol試劑購自天根生化科技公司,引物購自上海生工生物公司,Premix Ex TaqTM試劑、逆轉錄試劑購自大連寶生生物工程公司,羅氏實時熒光定量 PCR儀Lightcycler 480R(Software 1.5)。

1.2.2 血清樣本采集：清晨空腹狀態下，采集受試對象靜脈血4 ml,放于無抗凝劑的標本采集管中。在室溫(20～25 ℃)放置60 min后,3000 r/min離心10 min后,分離血清1 ml至EP管中,12000 r/min離心10 min后,留取上清800 μl于-80 ℃冰箱凍存備用。

1.2.3 RT-qPCR法測定血清中LncRNA表達：利用Trizol試劑快速提取法提取血清中總RNA，并用核酸測定儀測定RNA含量。取2 μg經DNA酶處理后,反轉錄為cDNA,合成的cDNA存于-20 ℃冰箱備用。反應體系共20 μl包括：cDNA 2μl，Taq酶10 μl，上下游引物各0.5 μl，EvaGreen 1 μl ，ddH20 6 μl，將上述混合物渦旋振蕩，充分混勻。RT-qPCR反應條件:95 ℃ 30 s預變性,95 ℃ 5 s,63 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s重復40個循環。96孔板進行樣本篩選,每個樣本進行3次重復實驗。在羅氏實時熒光定量 PCR儀Lightcycler480R上進行反應。反應結束后利用 Software 1.5對結果進行CT值分析，以GAPDH作為內參按照2-ΔΔCT算法進行基因相對表達量分析。所有實驗引物均由Primer Blast 網站設計。LncRNA miR155HG的正義鏈引物序列為5’-TGGAACAAATTGCTGCCGTG-3’，反義鏈引物序列為5’-AGGTTGAACATC

C-CAGTGACC-3’。 GAPDH的正義鏈引物序列為5’-ATTTGGCTACAGCAACAGGGTG-3’，反義鏈引物序列為5’-TGGTTGAGCACAGGGTACTTTATTG-3’。RT-qPCR反應特異性由熔解曲線判斷，若呈單峰則特異。

1.2.4 隨訪：所有患者自在醫院接受手術治療出院后開始進行隨訪，隨訪采用電話以及復查方式進行，隨訪截至2018年12月。本研究將整體生存期(OS) 定義為接受手術時間到死亡時間。

2 結 果

2.1 LUAD患者血清LncRNA miR155HG的表達水平 我們通過RT-qPCR方法檢測LncRNA miR155HG在LUAD患者血清和健康對照組血清中的表達水平，以GAPDH作為內參按照2-ΔΔCT算法進行基因相對表達量分析。比較發現，LncRNA miR155HG在LUAD患者血清中表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.0001)，見圖1。

2.2 LncRNA miR155HG表達水平與LUAD臨床特征相關性 LncRNA miR155HG表達水平與LUAD臨床特征，如性別、年齡、腫瘤直徑，淋巴結轉移，遠端轉移等均無相關性，差異無統計學意義(均P>0.05)，見表1。

表1 LncRNA miR155HG表達水平與LUAD臨床特征相關性(例)

2.3 LncRNA miR155HG作為LUAD診斷的分子標志物 用ROC曲線對LncRNA miR155HG用于LUAD診斷的效能進行評價，見圖2 。ROC 曲線下面積(AUC) 為0.8105(P<0.0001) 。LncRNA miR155HG診斷LUAD的敏感度及特異度分別為91.56%、70.55%。LncRNA miR155HG可以作為LUAD診斷的分子標志物。

圖2 LncRNA miR155HG診斷LUAD的ROC 曲線

2.4 LncRNA miR155HG不能作為預測LUAD預后的分子標志物 在完成隨訪的38例LUAD患者中，以LncRNA miR155HG表達水平(2-ΔΔCT) 的均數(mean) 為截斷值,高于6.85者為低表達組(21例)，低于6.85者為高表達組(21例)。LncRNA miR155HG高表達者預后優于低表達組，但差異無統計學意義(P=0.12)。LncRNA miR155HG不能作為預測LUAD預后的分子標志物。見圖3。

圖3 LncRNA miR155HG表達水平與LUAD預后的相關性

3 討 論

本研究利用人血清標本，探討了LncRNA miR155HG在LUAD患者血清和健康對照組血清中的差異表達情況，分析其表達水平與LUAD患者臨床特征的相關性，并評價其作為LUAD診斷生物標志物的可能性。本研究對于了解LncRNA miR155HG在LUAD發生中的作用及為LUAD的早期診斷提供了新的線索和依據。

LncRNA最初被認為是RNA聚合酶 Ⅱ 轉錄的副產物，沒有生物功能。然而，越來越多的證據表明LncRNA具有多種生物功能。比如已知的LncRNA具有異質性，可以介導表觀遺傳變化，招募染色質重塑復合物到特定的基因組位點，從而改變啟動子在基因組的染色質狀態，影響基因表達。LncRNA的另一重要機制是調控轉錄，轉錄因子或其他蛋白成分的相互作用調控轉錄。LncRNA可能隔離在細胞質中的轉錄因子，防止其移位到細胞核。另外，LncRNA還具備調控轉錄后的功能，對RNA的誘導作用，對microRNA的涂抹作用，組成RNP，抑制mRNA翻譯，調控剪接和降解mRNA的功能[9-10]。

盡管LncRNA的生物功能還未完全已知，LncRNA在腫瘤的發生發展、預后甚至轉移過程中起到關鍵作用越來越被人們重視。比如LncRNA HOTAIR，一個位于12q13上HOXC位點上的LncRNA，起初認為在人類乳腺癌中具有基本作用。它通過與PRC2結合，使HOXC部分位點沉默，從而誘導H3-賴氨酸27-三甲化，進而像胚胎成纖維細胞那樣重塑乳腺上皮細胞的基因表達模式[11]。然而有研究指出LncRNA HOTAIR在非小細胞肺癌中高水平異常表達,能夠提高非小細胞肺癌細胞遷移與侵襲水平,可能和患者的不良預后有聯系[12]。這表明LncRNA 具有非特異性。LncRNA XIST通過調控miR-186-5p促進非小細胞肺癌的增殖[13]。LncRNA HULC最初在肝癌組織中發現表達失調。近來有文獻表明LncRNA HULC在NSCLC組織中有明顯的高表達，這與LncRNA HULC在蛋白酪氨酸磷酸酶受體O(PTPRO)中具有負向作用有關[14]。另有文獻表明，抑制LncRNA HULC的表達促進腫瘤細胞的凋亡并抑制腫瘤細胞的增殖[15]。在細胞代謝過程中，LncRNA ANRIL可以與CBX7蛋白相互作用，形成PRC1多克隆蛋白復合物的一部分，從而參與前列腺癌的發生[16]。LncRNA MALAT1首先在肺癌中發現，后有研究顯示其調控ULK1 依賴性自噬的發生是由miR-558參與介導，從而保護心肌細胞并改善心臟功能[17]。

LncRNA miR155HG在轉基因小鼠模型中具有致癌基因活性[18]。在慢性淋巴細胞白血病中，轉錄因子MYB激活LncRNA miR155HG的活性，導致LncRNA miR155HG的表觀遺傳性狀改變從而引起其異常升高[19]。LncRNA miR155HG在免疫應答機制中發揮重要作用，參與多種免疫特異性轉錄物的表達。文獻報道，LncRNA miR155HG在多種腫瘤，如UAD、膽管癌、皮膚黑色素瘤、乳腺癌、腎細胞瘤等中的表達水平和腫瘤純度、免疫細胞如B淋巴細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞有關[20]。在慢性阻塞性肺疾病的發展中，LncRNA miR155HG調節M1/M2巨噬細胞極化[21]。LncRNA miR155HG在甲型流感病毒感染期間參與調節宿主先天免疫功能[22]。

在本組研究中，LncRNA miR155HG在LUAD患者血清中的表達高于健康對照組血清表達情況。有文獻報道LncRNA miR155HG在LUAD組織和癌旁組織的對比中有高表達，間接支持了我們的結果[23]。分析LncRNA miR155HG與LUAD臨床特征相關性時，結果顯示LncRNA miR155HG表達水平與LUAD患者的臨床特征無關，如性別、年齡、腫瘤直徑、淋巴結轉移情況、遠端轉移情況等。

我們分析ROC曲線的結果表明,LncRNA miR155HG作為生物標志物診斷LUAD時，其曲線下面積、靈敏度及特異度分別為0.8105，91.56%、70.55%。研究結果提示LncRNA miR155HG可能與LUAD的發生過程有關，且具有作為LUAD診斷生物標志物的可能性，這將為LUAD的早期診斷帶來新的方向。

LncRNA miR155HG與LUAD患者生存狀態相關性方面，據Peng等[22]的研究表明在LUAD中高表達組的患者OS長于低表達組，且差異具有統計學意義，說明LncRNA miR155HG與LUAD預后相關。然而在本組研究中LncRNA miR155HG高表達組OS雖然長于低表達組，但差異無統計學意義，即LncRNA miR155HG與LUAD預后無關。產生兩種結果不一致的原因，一方面可能由于兩組研究的樣本類型不同。另一方面也可能由于隨訪時間及樣本例數的限制。隨著未來隨訪時間的延長及研究相關病例數的擴大，LncRNA miR155HG表達水平與LUAD患者OS之間可能會出現相關性，但目前的研究結果仍然提示LncRNA miR155HG與LUAD的預后無關。

最近幾年，有報道稱血漿和血清中LncRNA可作為腫瘤特異性生物標記物用于腫瘤檢測。LncRNA常形成高度穩定的二級結構，使定量檢測體內游離RNA成為可能。更重要的是，一些循環LncRNA已經被證明是腫瘤診斷有價值的生物標志物，如胃癌血漿中的H19，前列腺癌中的尿MALAT-1，這些循環 LncRNA在人體體液中大量富集，可實時檢測。目前對于LUAD的常規診斷方法主要為病理檢查和血清腫瘤標志物監測，前者只局限于腫瘤體形成時才能檢測到，并且為有創檢查，對患者造成身心痛苦。而后者對腫瘤監測的特異性和敏感性均不強。血清中LncRNA miR155HG不僅可以為LUAD的早期診斷和治療提供新線索，還具有無創便捷的優勢。

綜上所述，本研究首次在LUAD患者血清中檢測LncRNA miR155HG,并對其作為LUAD生物標志物的價值進行評價。研究顯示，血清中LncRNA miR155HG具有作為LUAD分子標志物的可能性，對其相關機制尚需要后續深入研究。