慢性阻塞性肺疾病動物模型研究進展

曾德優，張六一，肖 創，王略力，黃 蓉，方 雁，，杜曉華，Yusef Absi(約旦)，陳 晨， 楊為民

(1.昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500；2.昆明醫科大學第一附屬醫院，云南 昆明 650031)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種常見的、可以預防和治療的呼吸系統疾病，以持續呼吸癥狀和氣流受限為特征，通常是由于暴露于有毒顆粒或氣體引起的氣道和肺泡病變所致[1]。臨床上COPD分為穩定期和急性加重期(Acute exacerbation of COPD，AECOPD)，病毒和細菌感染是導致COPD急性加重的主要誘因。AECOPD患者全身炎癥反應增強，目前應用最廣泛的治療藥物是糖皮質激素[2]，其在降低COPD患者住院率、病死率和疾病嚴重程度方面發揮著關鍵作用[3]。

1 模型動物

COPD動物模型的肺部解剖結構應與人類相似，以便更好模擬人類COPD的病理生理特征。目前建立COPD模型的動物種類繁多，例如大鼠、小鼠、犬、羊、家兔、猴子、小型豬等。其中嚙齒類小動物是最常用的COPD、AECOPD模型動物。大小鼠生命周期短，品系多，易飼養，生長發育快，性情較溫馴，飼養繁殖成本較低；其生理特征、病理特征與人類有很多相似[4-5]。其優點有基因背景明確、可操作性好、飼養和維護費用低、節省人力和物力等[6]。且大多數選擇SPF級Wistar大鼠、SD大鼠、C57BL/6小鼠、BALB/C小鼠、昆明小鼠等作為復制COPD、AECOPD疾病模型的動物。

2 常用COPD大小鼠模型造模方法

2.1 單因素誘導模型

2.1.1 香煙煙霧模型：香煙煙霧(Cigarette smoke，CS)的刺激可誘導氣道基因表達的改變，還會增強肺部的氧化應激反應，引起肺部的局部炎癥和小氣道重塑[7-8]。Xiao等[9]通過長期CS暴露28周的方法成功建立了COPD大鼠模型。Beckett等[10]采用CS口鼻暴露小鼠8周后出現氣道重塑、肺氣腫和肺功能下降。CS暴露誘導建立的COPD大小鼠模型符合COPD的許多疾病特征，但不同的動物對CS的敏感程度不一樣[11]；此外，CS暴露的方法和時間也會導致COPD大小鼠模型的誘導結果不一致[8]。其中，采用單純CS口鼻暴露小鼠八周以上的方法效果更佳，且暴露時間還可適當延長。

2.1.2 脂多糖模型：脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是效應較強的致熱源革蘭陰性菌內毒素的活性成分和特有結構[12]，可引起氣道上皮損傷，誘發氣道炎癥。常以氣管內滴注、滴鼻吸入的方式來誘導COPD模型，且通過反復滴注可模擬反復感染[13]。LPS導致的肺部病理生理學變化與COPD模型的表現很相似[14]。有研究表明[15]，單獨采用LPS暴露的方法可成功誘導建立COPD動物模型。LPS誘導建立的COPD大小鼠模型的病理變化符合COPD的病理特征，且造模時間短，方法簡便易行[16]，其中以氣管內滴注的方式來復制COPD動物模型效果更好。

2.1.3 蛋白酶模型：蛋白酶(Protease)是生物體內的一類酵素(酶)，以豬胰彈性蛋白酶應用最廣泛；蛋白酶誘導建立COPD動物模型的方法是通過模擬COPD發病時蛋白酶/抗蛋白酶失衡機制[17]；造模方法主要有氣管內滴入、霧化吸入、氣管切開注射等。以蛋白酶誘導建立的COPD動物模型表現與COPD臨床患者癥狀相似[18]。Ueno等[19]將豬胰彈性蛋白酶滴入小鼠氣管，隨時間的增加，小鼠肺泡破壞程度和炎癥反應加重。該法造模簡單迅速，動物感染少，模型病變程度可控，但是蛋白酶作用的發揮受動物品種、病理、生理機制等因素的影響[20]。

2.1.4 呼吸道病毒感染模型：呼吸道炎癥的誘因包括呼吸道病毒、細菌等。有研究表明[21]，COPD患者對甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)易感性會增加。IAV感染后的模型動物肺部及全身炎癥的表達水平升高、支氣管擴張劑的反應水平降低[22]。通過對大鼠進行氣道銅綠假單胞菌反復感染的方法建立的COPD大鼠模型表現出明顯的COPD樣病理學變化[23]。呼吸道感染雖然符合COPD臨床誘因，但是要求維持合適的感染量[24]。通過氣管內滴注病毒造成呼吸道感染的方法對實驗操作及環境要求較高，但是模型效果較好。

2.1.5 大氣污染物模型：英國生物樣本庫的一項基于人群研究證實了大氣污染與COPD患病率增加有關[25]。有研究表明[26]臭氧、二氧化氮、二氧化硫等大氣污染物的濃度和COPD的發病率呈明顯的正相關性。Gao等[27]通過臭氧暴露C57BL/6小鼠的方法成功建立了COPD模型。Wu等[28]研究發現高濃度PM2.5會降低肺功能通氣指標，抑制人的肺功能。通過臭氧、PM2.5等大氣污染物誘導復制COPD大小鼠模型的方法包括氣管內滴注、吸入等。

2.1.6 基因調控模型：COPD是一種多基因遺傳易感性疾病，有研究表明[29]，在造成COPD疾病發作的因素中，易感性遺傳基因是一個重要的因素。Richmond等[30]對小鼠特定基因進行敲除，影響小鼠氣道表面分泌型免疫球蛋白A的表達，成功誘導出了小鼠COPD疾病模型。Borel等[31]運用第三代基因編輯技術成功復制出了小鼠COPD疾病模型。基因調控的方法是近年來興起的一種新方法，能為COPD發病機制、疾病模型建立及相關研究提供新的研究方向。

2.2 復合因素誘導模型

2.2.1 香煙煙霧暴露聯合脂多糖模型：CS暴露聯合LPS的方法是目前國內外最常用的COPD造模方法。有研究表明[32]，CS暴露聯合LPS誘導的COPD動物模型與人類COPD的病理表現更相似，造模成功后的動物支氣管管腔變形，肺泡壁變薄斷裂，管壁周圍炎性細胞浸潤。Shin等[33]對小鼠進行CS暴露7 d，第4天氣管內滴入LPS，結果表明小鼠肺部生理結構發生改變，且肺部出現炎癥反應。Lee等[34]的研究通過煙熏和內毒素聯合的方法建立COPD動物模型，結果顯示該方法復制的模型動物炎癥反應比單純煙熏法或單純內毒素法較明顯。張卓紅等[35]采用CS暴露與氣管內注射LPS建立COPD大鼠模型，結果顯示模型組造模過程中第0.3 s用力呼氣容積、第0.3 s用力呼氣容積與用力肺活量的比值均低于對照組。應用香煙煙霧暴露聯合脂多糖法建立COPD大小鼠模型，可以大大縮短COPD的造模時間，提高動物模型的穩定性，但是該造模方法影響因素較多，LPS給入的時間及劑量各異。

2.2.2 香煙煙霧暴露聯合蛋白酶模型:Saluja等[36]的研究采用人唾液彈性蛋白酶聯合香煙煙霧提取物氣管內滴注大鼠，結果提示大鼠肺部結節白細胞浸潤、肺泡增大，表明COPD大鼠模型基本復制成功。CS暴露聯合氣管內注入蛋白酶的方法可以減少蛋白酶的用量，縮短造模的時間；但CS暴露聯合蛋白酶模型也存在一些缺陷，如氣管內滴注蛋白酶時需要對模型動物進行氣管切開，加之煙霧暴露的過程，易造成模型動物創傷難以恢復甚至誘發感染。

2.2.3 香煙煙霧暴露聯合細顆粒物(PM2.5)模型:大氣污染物中的主要成分PM2.5能滲透到肺泡引起明顯的炎癥和氧化應激等反應[37]。Gu等[38]將小鼠暴露于CS和PM2.5，成功復制出了COPD小鼠模型。Chu等[39]應用CS聯合PM2.5懸浮微粒吸入暴露的方法誘導小鼠模型，結果顯示模型小鼠肺部出現明顯的COPD病理學改變，提示COPD小鼠模型復制基本成功。雖然該方法目前使用不廣泛，但就目前國內吸煙人數的激增和PM 2.5污染形勢愈發地嚴峻，以此法建立COPD動物模型的研究具有一定的價值。

2.2.4 香煙煙霧暴露聯合流感病毒模型:目前COPD的發生危險因素眾多，且機制尚未明確,呼吸道病毒的感染也是COPD惡化及COPD急性加重期發生的重要因素。AECOPD患者全身炎癥反應加強，臨床上常用的治療藥物一般為糖皮質激素和抗生素[2,40]。但是，糖皮質激素長期吸入和多種抗菌藥物聯合使用與COPD患者合并感染性肺炎的發生有密切關系[41]。有研究者使用常見的流感病毒在C57小鼠CS暴露20周后進行感染，發現小鼠氣道中TNF-α、IL-6等表達增加,炎癥急劇加重[42]。Xiao等[43]通過CS暴露18周聯合H1N1病毒感染C57BL/6 J雄性小鼠的方法成功建立了AECOPD小鼠模型。諸多研究表明,CS暴露聯合病毒感染對大小鼠COPD的發生發展有協同促進作用。

2.2.5 香煙煙霧暴露聯合細菌感染模型:COPD急性加重期的發病因素主要是細菌或病毒感染。有研究者[44]在香煙煙霧暴露SD大鼠90 d后，使用醫院獲得性肺炎常見的致病菌銅綠假單胞菌和社區獲得性肺炎的主要病原菌肺炎鏈球菌進行氣管內滴注，結果顯示銅綠假單胞菌組、肺炎鏈球菌組大鼠肺組織病理改變明顯加重，肺組織勻漿培養為陽性，提示AECOPD大鼠模型成功建立。Huang等[45]在C57BL/6J小鼠連續香煙煙霧暴露8周的過程中，每5 d 1次經鼻吸入0.1 ml的肺炎克雷伯菌液(6×108CFU/ml)成功建立小鼠AECOPD模型。采用香煙煙霧聯合氣管內滴注細菌的方法操作簡便、動物創傷較小，能較好的模擬AECOPD模型；而感染細菌采用滴鼻吸入的方法，動物吸入細菌混懸液的體積難以精準定量。

3 結 語

慢性阻塞性肺疾病是以慢性呼吸系統癥狀、肺功能損害、肺氣腫等為特征的一種臨床綜合征[46]，其主要的危險因素是吸煙,而細菌或病毒是AECOPD的主要誘因。AECOPD患者預后判斷指標尤為重要，有研究發現IFN-γ與AECOPD患者的肺功能和預后情況明顯相關,可作為判斷的可靠指標。人類COPD病因及機制等比較復雜，盡管近年來對COPD、AECOPD動物模型的研究不斷深入，但是大多數動物模型僅能模擬輕度病理、生理改變，難以精準復制。目前造模方法種類繁多，缺乏統一的標準，且單一因素誘導建模耗時長、成模效果較差，而采用多種因素聯合誘導建立COPD、AECOPD動物模型的方法也越來越多，但是模型效果差異較大。香煙煙霧暴露聯合脂多糖氣管內滴注誘導建立COPD大小鼠模型的方法可操作性較好、耗時較短、效果較為顯著。通過對多種COPD大小鼠動物模型的造模方法概述，同時評價這些造模方法的一些優缺點，可為COPD病理機制研究、新藥的研發及COPD動物模型的建立提供了一定的參考價值和基礎。